有机溶剂沉淀课件

1、有机溶剂沉淀法制作人：蒋益德 学号：1109080014 日期：2013.12.25教学目标1.说出有机溶剂沉淀法的原理2.说出有机溶剂沉淀时需具备哪些条件定义向水溶液里加入一定量亲水性有机溶剂，降低溶剂的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法谓之“有机溶剂沉淀法”。一.原理（2）水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了他的亲水性，导致脱水凝集。以上两个因素相比较，脱水作用可能较静电作用占更主要的地位。常用的沉淀用溶剂乙醇、丙酮的介电常数都较低，是最常用的沉淀用溶剂。2.5mol/L甘氨酸的介电常数很大，可以做蛋白质等生物高分子溶液的稳定剂。有

2、机溶剂沉淀生物高分子的特点是：分辨率高于盐析；因溶剂沸点较低，除去及回收方便。但有机溶剂沉淀法比盐析法易使蛋白质变性失活。二.操作条件的控制（一）溶剂选择 沉淀用有机溶剂的选择主要考虑以下几个方面的因素：（1）介电常数小，沉淀作用强。（2）对生物分子的变性作用小。（3）毒性小，挥发性适中。（4）沉淀用溶剂一般需能与水无限混溶，一些与水部分混溶或微溶的溶剂如氯仿、乙醚等也有使用。乙醇，由于沉淀作用强，沸点适中，无毒等优点，广泛用于沉淀蛋白质、核酸、多糖等生物高分子及氨基酸等。丙酮，沉淀作用大于乙醇。用丙酮代替乙醇作沉淀剂一般可以减少用量1/4到1/3。但沸点较低，挥发损失大，对肝脏有一定毒性，着

3、火点低等缺点应用不如乙醇广泛。(二)沉淀时温度控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的因素，有机溶剂存在下，大多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减少，因此低温下（最好低于0）沉淀的完全。实际操作中，还要考虑有机溶剂与水混合时热量的驱散。因此，整个操作过程需要高度冷却。一般先将蛋白质溶液冷却到0摄氏度左右，并把有机溶剂预冷到更低温度，在充分搅拌下加入冷的有机溶剂，以避免局部过浓应其蛋白质变性。（四）PH等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时，溶液ph应尽量在蛋白质等电点附近，但是ph的控制还必须考虑蛋白质的稳定性。例如很多酶的等电点在ph4-5之间，比其他稳定的ph范围低，因此ph应首先满足蛋白

4、质稳定性的条件，不能过低。另外，应避免让目的物与主要杂质带相反电荷，导致严重共沉作用。（五）离子强度的控制較低离子强度的存在往往有利于沉淀作用，甚至还有保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂相互溶解及稳定介质ph的作用。用溶剂沉淀蛋白质时离子强度以0.01-0.05mol/L为好，通常不应超过5%的含量。常用的所谓助沉剂多为低浓度的单价盐，有醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。这可能是增加了蛋白质分子的表面电荷，从而增强了分子间引力之故。（五）离子强度的控制 少量中性盐【离子强度较高时（0.2mol/L以上）】的存在，由于盐溶作用，会增大蛋白质在有机溶剂-水溶液的溶解度，并随离子强度增大而增大，所以用有机溶剂沉淀时应减少无机量。用硫酸铵盐析所得的沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀纯化，则事先应经脱盐，否则会增加有机溶剂用量。（六）样品浓度的控制与盐析相似，样品较稀时增加了溶剂投入量和损耗，降低了溶质收率，还易产生稀释变性，但共沉作用小，分离效果好。反之浓的样品会增加共沉作用，降低分辨率，变性的危险性也小于稀溶液。一般认为蛋白质的初浓度以0.5%2%为好，粘多糖则以1%2%较合适。有机溶剂沉淀法的优点、缺点与盐析法相比，有机溶剂沉淀法具有如下优点：1乙醇等有机溶剂易挥发2沉淀物与母液间的密度差较