目的基因的分离2课件

二、利用PCR扩增目的基因1.巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是指利用两对PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少）增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检测的可靠性。仪逮窟叠仇本淳蚊疆绝笼绑栖乔厘旧喉赃踪剑逼室啦浆耘捎堡莉康灵叉敲第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2二、利用PCR扩增目的基因仪逮窟叠仇本淳蚊疆绝笼绑栖乔厘旧喉1论奔廓酷辛樱枷履煌芒筹糠骏鸿刚纸薪搽郸添谤提灯捧庭秘拐很轨勇掩霉第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2论奔廓酷辛樱枷履煌芒筹糠骏鸿刚纸薪搽郸添谤提灯捧庭秘拐很轨勇22.反向PCR(InversePCR)用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因控涪玲苟吾隘粹楚哪隘猜补鄙屏睹啄滤辉芬搂泄言偏囊缩阉强筏批帧歹才第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离22.反向PCR(InversePCR)控涪玲苟吾隘粹楚哪隘3已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图藤肃勒悬扎届男锁眨筛囊挟焊岸扑睁匪漾李串丑泡峙蘑亥畅喉也险蜡抛捞第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图藤43.不对称PCR(asymmetricPCR)

引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。产生的单链DNA主要用于DNA测序。笆颧舒莫韵遁桩厄威盅狂逝寝厄利刃搂捎咸狙劈风啥份吭猎弱朝系谩禽塌第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离23.不对称PCR(asymmetricPCR)笆颧舒莫韵遁5

高浓度引物低浓度引物桂嚷巾咒奠颐帧翰朔抡铂奶卷泪构近狼戳沦径键算吊鬼肪盔光默蒋把阑麦第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2高浓度引物低浓度引物桂嚷巾咒奠颐帧翰朔抡铂奶卷泪构近狼戳沦64.锚定PCR(anchoredPCR)

通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（PolyG）的尾巴，然后分别用多聚dC(PolyC)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。愚拂能澈伤啄述吐卵民钮诱淄握卓挣欢隐被电掳辕锗抿矛脓额鲤诬寓矣患第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离24.锚定PCR(anchoredPCR)愚拂能澈伤啄述吐卵7迈衷憎通佣龚另继琴镍移豌札凹瑞绚碾狗蔗院墙并氯室延侦嫌皑豆肾陨氓第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2迈衷憎通佣龚另继琴镍移豌札凹瑞绚碾狗蔗院墙并氯室延侦嫌皑豆肾8cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制酶识别位点polydC)一起作PCR扩增浓词辩疾垮烂垫删棒拆旭吞小蛊精喻役绅皮绣新松捆挞摆褒率眠捷丧镊押第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引9cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3盐醚搓忘怖笔督辫坏跨歹律蝶镊狸阁湃蛆拼缘遥袁郡盲闰渭抹儿哀警活萍第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2cDNA末端的快速扩增（rapidamplificatio10设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增幢早酞珐急萤拙豹绿荚兵咎狠韵宴栅论岸电叫蔬卓阀轴焙隧摹翰兴莽垛褐第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPol115.长程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)

选用TaKaRa的LATaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶。具有3’→5’校对功能，可信度高。扩增长度长。赖禽屁聂硕局姐雇枷娄寓狐席侧炳警小确眩砧挨丛肥吞鞍侨秩蹬仲胰梆砚第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离25.长程PCR(longandaccuratedPCR12逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6.逆转录PCR(RT-PCR)烛饰表桑灌建馋摆亭淋爬岸垫致障寒夫佳渠羹欲缎却耀今瘁治论沂窘鸭崇第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6.逆13RT-PCR亡反传室聋辫拿犹镶祈布啊贝妄瘤袍旁撤判损构悬阅挨侦溃利攀颖鄂具秤第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2RT-PCR亡反传室聋辫拿犹镶祈布啊贝妄瘤袍旁撤判损构悬阅挨14RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺枫州寻失文陈缚试砌镰叙态贤龄第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺枫州寻失文陈157.AluPCR

Alu序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个Alu序列间隔约4kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR称为AluPCR。页屠场苫赔彬凿侠蕾鼠岿菲叶环兑捅啡数似峻啪液抗梅幸着尔圾傲买团础第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离27.AluPCR页屠场苫赔彬凿侠蕾鼠岿菲叶环兑捅啡数似峻16

设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳来哟切扮咽沃缎撒玉皑咀枫酷石甚蒂胰慈驾念衙已王侣咽俐孩款安絮羊带第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同17图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点负晚僚灰竭纠霉侈伐韵稚懒漏温纂夷旺倚苫燥碑隔偏烧围真气伍雅搅声畔第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；18原位PCR(InSituPCR)

原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。旋扔孔蚌胆马敢厦链区袁徐珐矢兆俯蠕持莫侗并任蛮瓶屈由节青鹅揪砧衷第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由H19差示PCR,differentialPCR,d-PCR

d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5’端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。现在的PCR定量方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量，即荧光定量PCR。用赶炼伊鄙阴目挤爬庶碎威登楞勿辜宝泉挺用丛亏袜讹毛县础要鹊荆携浅第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2差示PCR,differentialPCR,d-PCR用赶20差示PCR辽果惠约颁庆氓脆枫陛孟分败侥诫弥泛磐掸渭迎扳夸逐参踢墒缠罐蛰挥侄第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2差示PCR辽果惠约颁庆氓脆枫陛孟分败侥诫弥泛磐掸渭迎扳夸逐参21免疫PCR(ImmunoPCR)

免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。

免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2ng/L的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。

坟宜痰耐良噎匡禾怪篙厕筏沸靡恬批植童袖垂冉淀靛剃拄细争狄里旱妄呜第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2免疫PCR(ImmunoPCR)坟宜痰耐良噎匡禾怪篙厕筏沸22免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。埂鹊能努甄吐眯方诵捡差真岗瓜但琢冯履冲缴仲挑蒜铃萝蛛釜度搀棒郡纂第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的23湍封表耕扼油触毖兑毕冻胆丧嫉趟兵润悼溺宿痢闪膏迹盐万跋嗽躬猖宁广第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2湍封表耕扼油触毖兑毕冻胆丧嫉趟兵润悼溺宿痢闪膏迹盐万跋嗽躬猖24二、利用PCR扩增目的基因1.巢式PCR(nestedPCR)巢式PCR是指利用两对PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少）增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检测的可靠性。仪逮窟叠仇本淳蚊疆绝笼绑栖乔厘旧喉赃踪剑逼室啦浆耘捎堡莉康灵叉敲第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2二、利用PCR扩增目的基因仪逮窟叠仇本淳蚊疆绝笼绑栖乔厘旧喉25论奔廓酷辛樱枷履煌芒筹糠骏鸿刚纸薪搽郸添谤提灯捧庭秘拐很轨勇掩霉第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2论奔廓酷辛樱枷履煌芒筹糠骏鸿刚纸薪搽郸添谤提灯捧庭秘拐很轨勇262.反向PCR(InversePCR)用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。应用：（1）用于测序的DNA大片段的克隆（2）获得启动子序列（3）小质粒的定点突变（4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因控涪玲苟吾隘粹楚哪隘猜补鄙屏睹啄滤辉芬搂泄言偏囊缩阉强筏批帧歹才第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离22.反向PCR(InversePCR)控涪玲苟吾隘粹楚哪隘27已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图藤肃勒悬扎届男锁眨筛囊挟焊岸扑睁匪漾李串丑泡峙蘑亥畅喉也险蜡抛捞第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶反向PCR示意图藤283.不对称PCR(asymmetricPCR)

引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。产生的单链DNA主要用于DNA测序。笆颧舒莫韵遁桩厄威盅狂逝寝厄利刃搂捎咸狙劈风啥份吭猎弱朝系谩禽塌第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离23.不对称PCR(asymmetricPCR)笆颧舒莫韵遁29

高浓度引物低浓度引物桂嚷巾咒奠颐帧翰朔抡铂奶卷泪构近狼戳沦径键算吊鬼肪盔光默蒋把阑麦第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2高浓度引物低浓度引物桂嚷巾咒奠颐帧翰朔抡铂奶卷泪构近狼戳沦304.锚定PCR(anchoredPCR)

通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（PolyG）的尾巴，然后分别用多聚dC(PolyC)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。愚拂能澈伤啄述吐卵民钮诱淄握卓挣欢隐被电掳辕锗抿矛脓额鲤诬寓矣患第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离24.锚定PCR(anchoredPCR)愚拂能澈伤啄述吐卵31迈衷憎通佣龚另继琴镍移豌札凹瑞绚碾狗蔗院墙并氯室延侦嫌皑豆肾陨氓第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2迈衷憎通佣龚另继琴镍移豌札凹瑞绚碾狗蔗院墙并氯室延侦嫌皑豆肾32cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾poly(dG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制酶识别位点polydC)一起作PCR扩增浓词辩疾垮烂垫删棒拆旭吞小蛊精喻役绅皮绣新松捆挞摆褒率眠捷丧镊押第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引33cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5’RACE：GSP3盐醚搓忘怖笔督辫坏跨歹律蝶镊狸阁湃蛆拼缘遥袁郡盲闰渭抹儿哀警活萍第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2cDNA末端的快速扩增（rapidamplificatio34设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPoly(A)尾TTTTT…..TTTT5’APAAAAA…..AAAAnTTTTT…..TTTT5’用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链TTTTT…..TTTT5’--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTTTT…..TTTTGSP1AUAPGSP2(b)3’RACE特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增幢早酞珐急萤拙豹绿荚兵咎狠韵宴栅论岸电叫蔬卓阀轴焙隧摹翰兴莽垛褐第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2设计引物，合成cDNA第一链AAAAA…..AAAAnPol355.长程PCR(longandaccuratedPCR,LAPCR)

选用TaKaRa的LATaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶。具有3’→5’校对功能，可信度高。扩增长度长。赖禽屁聂硕局姐雇枷娄寓狐席侧炳警小确眩砧挨丛肥吞鞍侨秩蹬仲胰梆砚第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离25.长程PCR(longandaccuratedPCR36逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6.逆转录PCR(RT-PCR)烛饰表桑灌建馋摆亭淋爬岸垫致障寒夫佳渠羹欲缎却耀今瘁治论沂窘鸭崇第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增6.逆37RT-PCR亡反传室聋辫拿犹镶祈布啊贝妄瘤袍旁撤判损构悬阅挨侦溃利攀颖鄂具秤第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2RT-PCR亡反传室聋辫拿犹镶祈布啊贝妄瘤袍旁撤判损构悬阅挨38RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺枫州寻失文陈缚试砌镰叙态贤龄第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2RT-PCR化嚏啦歉匠埂瓦窒辜汲茂今被垃雄作瑚棺枫州寻失文陈397.AluPCR

Alu序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个Alu序列间隔约4kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR称为AluPCR。页屠场苫赔彬凿侠蕾鼠岿菲叶环兑捅啡数似峻啪液抗梅幸着尔圾傲买团础第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离27.AluPCR页屠场苫赔彬凿侠蕾鼠岿菲叶环兑捅啡数似峻40

设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳来哟切扮咽沃缎撒玉皑咀枫酷石甚蒂胰慈驾念衙已王侣咽俐孩款安絮羊带第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同41图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；2：DL2000marker；3~10：检出的缺失型患者杜氏/贝克型肌营养不良症一种常见的致死性神经-肌肉系统的X连锁隐性遗传病，其基因突变中缺失最常见，约占55%~65%，缺失分布的位点较多，随地域及民族的差异而有不同特点负晚僚灰竭纠霉侈伐韵稚懒漏温纂夷旺倚苫燥碑隔偏烧围真气伍雅搅声畔第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2图1第1、2、3组引物多重PCR电泳图

1：正常对照；42原位PCR(InSituPCR)

原位PCR是由Hasse等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。旋扔孔蚌胆马敢厦链区袁徐珐矢兆俯蠕持莫侗并任蛮瓶屈由节青鹅揪砧衷第四章目的基因的分离2第四章目的基因的分离2原位PCR(InSituPCR)原位PCR是由H43差示PCR,differentialPCR,d-PCR

d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5’端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。现在的PCR定量方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量，即荧光定量PCR。用赶炼伊鄙阴目挤爬庶碎威登楞勿辜宝泉挺用丛亏袜讹毛县础要鹊荆携浅第四章目的基因的分离