RNA合成20056 生物化学　教学课件

内容概要：第一节依赖DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二、模板链与非模板链三、E.coliRNA聚合酶的组成与功能特征四、转录的基本过程第二节RNA合成的起始小结第三节RNA合成的终止第四节真核生物细胞核RNA聚合酶第六节以RNA为模板的DNA和RNA合成第五节新生RNA的剪切和修饰第十二章RNA的生物合成内容概要：第一节依赖DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二1引言生物遗传信息传递的化学本质，在分子水平看就是：DNARNA复制本质：遗传信息全部传递给子代DNA分子。随分裂DNA进入子细胞，通过表达的蛋白质控制生长发育。蛋白质转录翻译蛋白质是生命活动的体现者，不同时期DNA表达不同蛋白质从而控制整个生命活动过程。在生物体体系DNA如何指导RNA合成？引言生物遗传信息传递的化学本质，在分子水平看就2第一节原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合成的酶RNA聚合酶全称：依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-dependentRNApolymerase)，简称RNA聚合酶(RNApolymerase)。又称为转录酶(transcriptase)。n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPDNA(模板)，Mg2+RNA聚合酶RNA+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA聚合酶催化如下的反应:RNA合成中底物或原料第一节原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合3转录最大特点：信息传递具有选择性①转录时DNA两条链中只有其中一条链作模板；因为转录的RNA只能与变性DNA中的一条链形成杂种分子。②转录的RNA仅拷贝了DNA中的某个片段的信息(部分功能单位-基因)；处于转录过程的DNA和正在被合成的RNA用图示意如下:新合成RNA模板链非模板链转录最大特点：信息传递具有选择性①转录时DNA两条链中只有其4历时近半个世纪已经解决的基本问题：1、RNA聚合酶如何催化RNA合成？2、此时此刻被转录的信息由谁来识别？3、RNA合成基本过程如何？

Uchoa(西班牙)＆Kornberg因基因表达研究富有成果分享1959年诺贝尔医学奖；

1965年Jacob＆Monod(法)提出并证实操纵子学说与woff分享诺贝尔医学奖；

1975年Tiemin＆Baltimore由于发现肿瘤病毒逆转录酶，共享诺贝尔生理医学奖；历时近半个世纪已经解决的基本问题：1、RNA聚合酶如何催化R5DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化的转录过程:转录泡~17bp模板链(非编码链)RNA5'非模板链(编码链)RNA-DNA杂螺旋活性位点：RNA3′端逐个添加NMP；速度：50~90nt/sRNA合成方向5'→3'RNA聚合酶沿模板链从3'→5'移动DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化6AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板DNAAUCOOO5pppOppp~~AOHpp~~OHGOpOHpp~~UOpOHRNA聚合酶在引物3-OH上添加单核苷酸催化机理：进位的NTP受活性中心模板上碱基限制：互补原则决定进位的核苷三磷酸和被添加在3-端的核苷酸种类。进位后聚合酶作用下形成3-磷酸酯键，单核苷酸被添加上。RNA聚合酶活性中心AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板7用于指导RNA合成的链叫模板链，也称为负链或无意义链。互补于模板链的DNA链叫非模板链，也叫正链或有意义链。5'GACAACTTGAGAACCG3'非模板链（编码链）3'CTGTTGAACTCTTGGC5'

模板链5'AACUUGAGAA3'←RNA二、模板链与非模板链DNA用于指导RNA合成互补于模板链的DNA链5'GACAACTT8RNA聚合酶全酶：亚基基因相对分子量组分功能αββ′σrpoArpoBrpoCrpoDrpoE

4.0×1041.55

×105

1.6×105

8.5×104

1.1×104核心酶核心酶核心酶σ因子结合启动子区结合核苷酸结合膜板DNA负责转录起始不明每个分子含5个亚基：α2ββ

-核心酶(coreenzyme)；σ-起始因子ββ′σ三、E.coliRNA聚合酶的组成与功能特征RNA聚合酶全酶：亚基基因相对分子量组分功9四、转录的基本过程起始RNA聚合酶从起始位点开始转录，合成pppNpN后，σ因子解离。延伸由核心酶完成。核心酶延伸核心酶沿DNA模板链从3'→5'移动在反应中心于RNA

3'逐个添加核苷酸。终止核心酶遇到终止子后，RNA自动脱离核心酶或在ρ因子帮助下脱离核心酶，终止合成。四、转录的基本过程起始RNA聚合酶从起始位点开始转录，合成p10复制起始:RNA合成起始位点与其上游存在的聚合酶识别位点、结合位点构成的特有DNA序列。DNA模板链对RNA合成起指导作用的第一个碱基计为+1区；也叫起始位点；在编码链中一般为A或G。5'GCCAUGAATTGACACCAGAGCCGGAAAGAACATATAATCACCACACCAACGA3'DNA编码链起始位点正区负区下游上游-10区(称为Pribnow框σ70因子紧密结合区)-35区(识别区，即σ70因子识别结合区)启动子：DNA分子中用于转录起始的三个特殊碱基序列构成。σ核心酶pppApN3'OHRNA合成起始，σ脱离核心酶，后续的RNA合成由核心酶完成复制起始:RNA合成起始位点与其上游存在的聚合酶识别位点、结11大肠杆菌σ因子的编码基因及启动子的特征σ70σ32σ54起始因子启动基因功能－35区核心序列序列长度－10区核心序列rpoDrpoHrpoNTTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA许多热休克参与氮代谢16~1813~156TATAATCCCATNTATTGCA大肠杆菌σ因子的编码基因及启动子的特征σ70σ32σ54起始12因子被启动基因功能－35区间距－10区

σ70

rpoD许多TTGACA

16~18σ32

rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA

13~15σ54

rpoN

参与氮代谢

CTGGNA

6因子被启动基因功能－35区13RNA合成的终止真核生物中转录终止过程仍不清楚，在E.coli染色体DNA中已知的至少有两种终止信号：1、具有转录成自身互补序列的区域，它能在RNA链末端之前15~20个核苷酸为中心处形成一个发夹式结构，该结构能够的形成能打断转录复合物中的RNA-DNA杂交部分，使RNA从整个复合物解离。不依赖于ρ因子的终止子有两个特性：①依赖于ρ因子(蛋白质)的终止子；②不依赖于ρ因子的终止子。RNA合成的终止真核生物中转录终止过程仍不清楚，在E.col142、由模板链上polyA转录而成的RNA3′端具有polyU序列RNA-polyU与DNA-polyA结合很不稳定，很容易从模板DNA上解离而终止合成。CCCACACCCGGCGCCTAATGAGCGCCGATTTTTTTTGGGTGTGGGCCGCGGATTAGTCGCGGCTAAAAAAA3355回文结构富含GC区模板链转录方向UUUUUUUUpolyUAAUUGAC3'OH5'富含G∶CCGCGGCGCGCCGCCA发夹结构ACUGAGGA非polyUAAUUGAC3'OH5'不富含G:CAGAUGAUCUACUCCA发夹结构不依赖于ρ因子的终止信号转录的RNA依赖于ρ因子的终止信号转录的RNA富含AT区2、由模板链上polyA转录而成的RNA3′端具有polyU155'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5'不依赖于ρ因子的终止信号终止过程UUUUUU不依赖于ρ因子终止信号中的polyU与模板结合疏松，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于ρ因子的终止信号则没有polyU，因此需要ρ因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。ρ因子能沿着RNA从5'3'滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。UUUUUU5'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5165'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'5'依赖于ρ因子的终止信号终止过程不依赖于ρ因子终止信号中的polyU与模板结合疏松，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于ρ因子的终止信号则没有polyU，需要ρ因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。ρ因子能沿着RNA从5'3'滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。GCUAUC5'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'517第二节真核生物核的RNA合成负责核糖体rRNA18S、5.8S、28S的前体合成1.全酶结构比原核生物的复杂，起始因子(σ因子)种类多；2.已发现的有聚合酶有三种；合成过程与原核细胞基本相同；3.线粒体中具有不同于原核生物中的RNA聚合酶(小分子)。一、真核生物RNA聚合酶特点主要功能ⅠⅡⅢ-1RNApolase合成mRNA前体及大多数snRNA合成5srRNA前体和一些小RNA前体存在核仁核质核质Ⅲ-2合成tRNA前体核质第二节真核生物核的RNA合成负责核糖体rRNA18S、518二、真核细胞与原核细胞转录主要区别1.真核细胞中RNA聚合酶为聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并具有高度的分工，不同的聚合酶负责合成不同的RNA。2.真核细胞启动子比原核细胞启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶能识别不同的启动子。RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别识别Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类启动子。RNA聚合酶Ⅱ识别的Ⅱ类启动子主要包括4个部位：碱基大多数为A-T碱基对－25区富含AT的7个核苷酸。类似于原核启动子－10区的Pribnow。－75区的共有序列:GGNCAATCT，其中N为C或T。－100或更远的、增强转录速率的短在序列。转录起始部位:TATA框(TATAbox):CAAT框(CAATbox):增强子(enhancer):二、真核细胞与原核细胞转录主要区别1.真核细胞中RNA聚合酶19RNApolaseⅡ合成mRNA前体及大多数snRNA核质真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子结构调节序列TATAAA起始位点5'3'GGCCAATCT+1区起始位点上游或下游附近特殊的序列启动子-75区-25区3.原核细胞靠RNA聚合酶本身识别启动子，而真核细胞的RNA无法识别启动子，要靠转录因子(transcriptionfactor,TF)识别启动子。RNApolaseⅡ合成mRNA前体及大多数snRNA核20转录因子(transcriptionfactor,TF)是指参与转录起始有关的一类功能蛋白质。转录因子的功能是与启动子结合，通过蛋白质与蛋白质的相互作用，将RNA聚合酶锚于启动子处，促进基因转录。真核细胞转录因子对应于RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，分别称为TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ。其中TFⅡ种类较多，功能复杂，但研究也较深入。现在已经发现的TFⅡA、TFⅡB、TFⅡC、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH、TFⅡJ等。TF(transcriptionfactor)的功能:TF(transcriptionfactor)的种类:TFA-J是能识别结合TATA序列附近的蛋白质因子，称为通用转录因子(generalfactors,GTF)，或称为基本转录因子(basaltranscription)。转录因子(transcriptionfactor,TF)21通用转录因子(basaltranscriptionalactivators)可以与启动子附近或远离启动子的顺式原件结合，调控转录起始复合物的组装过程。这些因子有明显的DNA结合域和激活转录所需要的激活结构域。启动子特异转录激活因子(promoter-specfictranscriptionalactivators)通用基因转录准确起始必须因子，即在一般情况下他们都参与基因组成性表达。通用基因：糖一般代谢、脂类一般代谢、蛋白质一般代谢所有酶等蛋白质的编码基因。这些特异性转录因子在受生物胁迫(病源菌侵入)或非生物胁迫(热击、冷害、干旱、重金属毒害)时，才会调节和控制某些基因表达。即调控基因上游应答元件，如热击应答元件(heatshockresponseelement,HSE)、金属应答原件(metalresponseelement，MRE)等。通用转录因子(basaltranscriptionala22TATA(关键亚基TBP)框结合蛋白与TFⅡD结合，稳定TFD与TATA结合桥连蛋白:是TBP与TFⅡF-polⅡ结合的桥梁真核polⅡ在转录因子作用下形成转录起始复合物过程:5'3'TATAAA起始位点GGCCAATCTTFⅡD(TBP)TFⅡATFⅡBTFⅡHTFⅡJpolⅡTFⅡFTFⅡETATA(关键亚基TBP)框结合蛋白与TFⅡD结合，稳定TF23真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录过程所需的转录因子组成及功能转录因子亚基数Mr(kd)功能起始阶段RNA聚合酶Ⅱ1210~22催化RNA合成TBP（TATA盒138专门识别TATA盒子结合蛋白）TFⅡA312，19，35稳定TFⅡB和TFP对启动子的结合TFⅡB135结合于TFP；组装PolⅡ-TFⅡF复合物TFⅡD1215~25能与正调节、负调节蛋白相互作用TFⅡE234，57组装TFⅡH；ATP和解旋酶活性TFⅡF230，74紧密结合于PolⅡ，结合TFⅡB，防止RNA聚合酶结合于非特异DNA顺序TFⅡH1235~89启动子DNA解螺旋，磷酸化RNA聚合酶，组装核苷酸切割修复复合物；真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录过程所需的转录因子组成及功能转录因24顺式作用元件(cis-actingelement)，亦称应答元件(responseelement)。这些元件包括启动子、增强子(enhancer)、和沉默子(silencer)等。4.真核生物的转录受许多特定的顺式作用元件(cis-actingelement)和反式作用因子(trans-actingfactors)的影响。顺式作用元件的本质是存在启动子附近的短在DNA特有序列，对于转录启动和调控产生影响的核苷酸序列。顺式作用元件TATAAA起始位点-25区TATA盒子能控制转录的忠实性。5'3'GGCCAATCT-75区CAAT框能决定转录的起始频率。+1区调节基因表达活性决定启动频率也决定打开或沉默。顺式作用元件只有与反式作用因子(特有蛋白质)结合才能对转录启动频率或速度产生影响。下游上游顺式作用元件(cis-actingelement)，亦称应25增强子增强子(enhancer)位于上游，距离起点至少100bp以上，是一种远程控制元件，又称为上游激活序列(upstreamactivatorsequence,UAS)，它通过启动子来增强转录频率。增强子区由8～12bp的“核心”元件组成，共有序列为：TGGAAAG/TA/TA/T增强子结构一般特点:一般具有完整或部分回文序列结构，并以单拷贝或多拷贝的形式存在；通常距离+1区1～4kb，甚至在+1区的3kb之外起作用。增强子增强子(enhancer)位于上游，距离起点至少10026近年来已经证明，UAS通过以下方式起作用：影响超螺旋密度，使DNA双螺旋弯曲，改变模板的整体结构，便于转录起始。通过增强子可把模板固定在细胞内特定的位置，如连接在核基质上，以利于拓扑异构酶改变DNA双螺旋的张力，促进RNApolyⅡ在DNA链上结合滑动。可为RNApolyⅡ或其他重要蛋白质因子提供与染色质结合的“进入位点”。近年来已经证明，UAS通过以下方式起作用：影响超螺旋密度，27第三节转录后加工一、原核生物转录后加工原核生物mRNA一经转录不需要加工、修饰就具有模板活性，但是tRNA和rRNA的原初转录产物均需要经过一系列加工，才能成为活性分子。主要包括剪切、剪接形成5'-端和3'-端的特殊结构、碱基修饰、改变糖苷酸等过程。1.原核rRNA前体的加工E.Coli的rRNA前体分子沉降系数为30S(P30)，大约含6300个核苷酸残基。需要经过修饰、剪切、剪接形成16SrRNA、23SrRNA和几个tRNA。整个过程可以简单图示如下：第三节转录后加工一、原核生物转录后加工原核生物mRNA2816SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1)甲级化作用(2)RNaseⅢⅢⅢⅢ(3)RNaseEEE剪切16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNAP16Per-tRNAP23P530SRNA专一核酸酶内切酶甲级化常见形式2'-甲级核糖16SrRNA特有甲级化N4,2‘-O-甲级胞嘧啶(m4Cm)16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1292.原核tRNA前体的转录后加工E.Coli染色体基因组共有tRNA的基因约60个，除少数几个与rRNA一起转录，其余的大多数成族排列，转录成含两个或多个tRNA的前体，再进行加工。tRNA前体加工包括：①核酸内切酶剪切；②核酸外切酶从3'-端逐个切去附加顺序，进行修剪；③在tRNA3'-端添加CCCA-3'OH；④核苷酸的修饰和异构化。RNase与DNA内切酶不同，RNase不能识别特异序列，它所识别的是加工部位的空间结构。Per-tRNA加工、修饰工程简图示意如下：2.原核tRNA前体的转录后加工E.Coli染色体基因组共有30RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseFRNaseD异构化酶异构化酶CCA3'-OHCCA3'-OHtRNA前体加工过程中的核酸内切酶RNaseP能切出成熟5'-端的内切酶RNaseF加工tRNA3'-端的核酸内切酶RNaseDtRNA3'-端成熟的核酸外切酶tRNA核苷酰基转移酶per-tRNACCA3'-OH5'加工修饰RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseF31二、真核生物转录后的加工1.前体mRNA的加工原核生物大多数是含有几个遗传信息的多顺反子mRNA，仅有少数为单顺反子mRNA，由于转录与翻译过程偶联所以大多数原核生物mRNA大多不需要加工就直接进入翻译阶段。只有少数多顺反子mRNA需要加工，即需要剪切成小单位后，再进行翻译。真核生物的基因在DNA上是间隔排列的，这称为断裂基因。但是转录时间隔部分是被一起转录成前体RNA，必须经过剪切和剪接以除去内含子序列，转变成成熟的mRNA后，才能进一步实施后续的蛋白质翻译。3'-端添加polyA，5'-端戴帽，碱基甲级化修饰等。二、真核生物转录后的加工1.前体mRNA的加工原核生物大多数32mRNA初级转录本转录过程中或完成后在核内进行5'端加帽子外显子内含子外显子m7Gppp核内3'端加多聚A尾，胞质中也有相应酶系，还可以继续延长尾巴m7GpppAA(A)Na-OHmRNA前体剪切去除内含子，拼接外显子m7GpppAA(A)aA-OH转运核质胞质可翻译的mRNAm7GpppAA(A)aA-OH成熟的mRNA核膜孔甲基化，RNA编辑mRNA初级转录本转录过程中或完成后在核内进行5'端加帽子外332.前体rRNA加工rRNA基因是多拷贝的，如原核生物基因中rNRA基因有5～10拷贝；真核生物中rNRA拷贝数更多，如果蝇为260拷贝。而且rRNA基因是由非转录区(spacer)将它们间隔开来。在每一个rRNA基因内，包含3～4段rRNA的编码区，其间也有间隔区。间隔区有一些是无转录功能的，另有一些间隔区的转录产物是tRNA。16SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNA3'5'RNase5'3'RNA初级转录本核酸酶5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'16SrRNAtRNA23SrRNAtRNA5SrRNARNAs前体成熟RNAs2.前体rRNA加工rRNA基因是多拷贝的，如原核生物基因34第四节以RNA为模板的DNA和RNA合成一、逆(反)转录酶一些感染动物细胞的病毒含有存在与病毒颗粒中的反转录酶(reversetranscriptase)，这是一种依赖RNA的DNA聚合酶。感染后，单链RNA病毒基因组(约10000核苷酸长)和酶一起进入宿主细胞。反转录酶催化互补于病毒的一条DNA链的合成，形成RNA-DNA杂种分子，该酶同时能降解其中的RNA链，进一步合成另一条DNA链。双链DNA经常被整合入真核细胞的基因组中。在一定条件下该基因可被激活和转录，它的基因产物--病毒蛋白和病毒RNA一起包装产生新的病毒。含有逆转录酶的RNA病毒叫逆病毒。RNA逆转录转录蛋白质翻译DNA复制复制第四节以RNA为模板的DNA和RNA合成一、逆(反)转35逆转录酶逆转录酶(RNaseH)病毒RNA3'5'①依赖RNA的DNA聚合作用②降解RNA-DNA杂种分子中的RNA(即RNaseH活性)③依赖DNA的DNA聚合活性整合到寄主DNA中，适当的条件下激活而病变病毒RNA3'5'5'cDNA3'cDNA3'5'3'5'cDNA5'3'5'3'逆转录酶逆转录酶(RNaseH)病毒RNA3'5'①依赖RN36二、逆转录病毒引起癌症或爱滋病癌症发病的分子机制研究证明，逆病毒起着重要的作用。绝大多数逆病毒不杀伤它们的寄主细胞，它们整合到细胞DNA上并随之一起复制。然而，一些病毒有一额外的基因可使细胞癌变(生长异常)。这种病毒被归类为RNA肿瘤病毒。PeytonRaous第一个研究的逆病毒是鸡肉瘤病毒(命名为劳氏肉瘤病毒)，这种病毒和其他肿瘤病毒中的导致肿瘤的基因叫做致癌基因(oncongen)。自从HaroldVarmus＆Michael

Bishop发现致癌基因以来，在逆病毒中已经发现十几种不同的这类基因。人类获得性免疫缺陷病毒(humanimmunondeficience

virus,HIV)。这种艾滋病(AIDS病)的致病因子也是一种逆病毒。HIV杀死淋巴细胞，逐渐导致寄主免疫系统的抑制，而不是引起肿瘤，大部分治疗HIV感染的个体所用的药物的靶子是反转录酶。二、逆转录病毒引起癌症或爱滋病癌症发病的分子机制研究证明，逆371、E.coliRNA聚合酶全酶：α2ββ'σ，既能识别启动子，又能起始合成，不需要引物，合成起始后σ因子脱离核心酶，后续的延伸由核心酶完成；模板链起指导作用，合成的RNA与编码链内容相同(只是U代替了T)链延伸方向5'→3'(与复制相同)。小结2、转录的特点：选择性①DNA分子只有一条链用作模板指导RNA合成，合成的RNA与模板链碱基互补，而与编码链的碱基内容和顺序相同；②特定的时间只有一定的基因被转录；③转录的选择性原理已成为基因反义技术的内容。3、原核细胞转录启动子是DNA分子中起始位点－10~－35区的一段特定的核苷酸序列，该序列能被RNA全酶识别、结合并启动转录。1、E.coliRNA聚合酶全酶：α2ββ'σ，既能识别启38足迹法：利用DNA序列分析原理建立的一种DNA特定序列或基因检测技术。32P32P①DNA一条链末端被放射性标记的溶液(如32P-DNA)加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶②同种溶液分成两份限制性内切酶限制性内切酶③保温、酶切④变性、电泳③保温、酶切④变性、电泳当RNA聚合酶结合DNA后，限制性内切酶的一些切割位点被遮盖，切割次数减少，相比较溶液中缺少某些长度的DNA。酶作用结果酶作用结果＋－PAGE放射自显影DNA迁移方向失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶加入RNA聚合酶不加入RNA聚合酶失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点失去的区带，表明是RNA聚合酶结合DNA的位点被结合蛋白保护的样品在电泳图缺少的谱带处留下空白，即所谓的“足迹”。用这种方法可了解RNA聚合酶结合的DNA顺序足迹法：利用DNA序列分析原理建立的一种DNA特定序列或基因39对于一个特定的基因来说，编码链可以是给定染色体DNA双链中的任意一条。3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'5'编码编码编码编码转录产物RNA基因与DNA：①原核细胞、病毒DNA中基因可重叠；②生物体系基因转录具有不对称性：被打开的DNA转录时只是DNA分子中的一条链起模板作用；但另一条链也会反向编码另一种RNA，或从另一处启动正向编码一种RNA。重叠基因：两条链不同时期分别作模板对于一个特定的基因来说，编码链可以是给定染色体DNA3'540内容概要：第一节依赖DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二、模板链与非模板链三、E.coliRNA聚合酶的组成与功能特征四、转录的基本过程第二节RNA合成的起始小结第三节RNA合成的终止第四节真核生物细胞核RNA聚合酶第六节以RNA为模板的DNA和RNA合成第五节新生RNA的剪切和修饰第十二章RNA的生物合成内容概要：第一节依赖DNA的RNA合成一、RNA聚合酶二41引言生物遗传信息传递的化学本质，在分子水平看就是：DNARNA复制本质：遗传信息全部传递给子代DNA分子。随分裂DNA进入子细胞，通过表达的蛋白质控制生长发育。蛋白质转录翻译蛋白质是生命活动的体现者，不同时期DNA表达不同蛋白质从而控制整个生命活动过程。在生物体体系DNA如何指导RNA合成？引言生物遗传信息传递的化学本质，在分子水平看就42第一节原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合成的酶RNA聚合酶全称：依赖DNA的RNA聚合酶(DNA-dependentRNApolymerase)，简称RNA聚合酶(RNApolymerase)。又称为转录酶(transcriptase)。n1ATPn2GTPn3CTPn4UTPDNA(模板)，Mg2+RNA聚合酶RNA+(n1+n2+n3+n4)PPiRNA聚合酶催化如下的反应:RNA合成中底物或原料第一节原核生物RNA的合成一、RNA聚合酶——催化RNA合43转录最大特点：信息传递具有选择性①转录时DNA两条链中只有其中一条链作模板；因为转录的RNA只能与变性DNA中的一条链形成杂种分子。②转录的RNA仅拷贝了DNA中的某个片段的信息(部分功能单位-基因)；处于转录过程的DNA和正在被合成的RNA用图示意如下:新合成RNA模板链非模板链转录最大特点：信息传递具有选择性①转录时DNA两条链中只有其44历时近半个世纪已经解决的基本问题：1、RNA聚合酶如何催化RNA合成？2、此时此刻被转录的信息由谁来识别？3、RNA合成基本过程如何？

Uchoa(西班牙)＆Kornberg因基因表达研究富有成果分享1959年诺贝尔医学奖；

1965年Jacob＆Monod(法)提出并证实操纵子学说与woff分享诺贝尔医学奖；

1975年Tiemin＆Baltimore由于发现肿瘤病毒逆转录酶，共享诺贝尔生理医学奖；历时近半个世纪已经解决的基本问题：1、RNA聚合酶如何催化R45DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化的转录过程:转录泡~17bp模板链(非编码链)RNA5'非模板链(编码链)RNA-DNA杂螺旋活性位点：RNA3′端逐个添加NMP；速度：50~90nt/sRNA合成方向5'→3'RNA聚合酶沿模板链从3'→5'移动DNARNA聚合酶E.coli中正在工作的RNA聚合酶催化46AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板DNAAUCOOO5pppOppp~~AOHpp~~OHGOpOHpp~~UOpOHRNA聚合酶在引物3-OH上添加单核苷酸催化机理：进位的NTP受活性中心模板上碱基限制：互补原则决定进位的核苷三磷酸和被添加在3-端的核苷酸种类。进位后聚合酶作用下形成3-磷酸酯键，单核苷酸被添加上。RNA聚合酶活性中心AGTCOOOpO3AGTCOOOO5ppppppp模板47用于指导RNA合成的链叫模板链，也称为负链或无意义链。互补于模板链的DNA链叫非模板链，也叫正链或有意义链。5'GACAACTTGAGAACCG3'非模板链（编码链）3'CTGTTGAACTCTTGGC5'

模板链5'AACUUGAGAA3'←RNA二、模板链与非模板链DNA用于指导RNA合成互补于模板链的DNA链5'GACAACTT48RNA聚合酶全酶：亚基基因相对分子量组分功能αββ′σrpoArpoBrpoCrpoDrpoE

4.0×1041.55

×105

1.6×105

8.5×104

1.1×104核心酶核心酶核心酶σ因子结合启动子区结合核苷酸结合膜板DNA负责转录起始不明每个分子含5个亚基：α2ββ

-核心酶(coreenzyme)；σ-起始因子ββ′σ三、E.coliRNA聚合酶的组成与功能特征RNA聚合酶全酶：亚基基因相对分子量组分功49四、转录的基本过程起始RNA聚合酶从起始位点开始转录，合成pppNpN后，σ因子解离。延伸由核心酶完成。核心酶延伸核心酶沿DNA模板链从3'→5'移动在反应中心于RNA

3'逐个添加核苷酸。终止核心酶遇到终止子后，RNA自动脱离核心酶或在ρ因子帮助下脱离核心酶，终止合成。四、转录的基本过程起始RNA聚合酶从起始位点开始转录，合成p50复制起始:RNA合成起始位点与其上游存在的聚合酶识别位点、结合位点构成的特有DNA序列。DNA模板链对RNA合成起指导作用的第一个碱基计为+1区；也叫起始位点；在编码链中一般为A或G。5'GCCAUGAATTGACACCAGAGCCGGAAAGAACATATAATCACCACACCAACGA3'DNA编码链起始位点正区负区下游上游-10区(称为Pribnow框σ70因子紧密结合区)-35区(识别区，即σ70因子识别结合区)启动子：DNA分子中用于转录起始的三个特殊碱基序列构成。σ核心酶pppApN3'OHRNA合成起始，σ脱离核心酶，后续的RNA合成由核心酶完成复制起始:RNA合成起始位点与其上游存在的聚合酶识别位点、结51大肠杆菌σ因子的编码基因及启动子的特征σ70σ32σ54起始因子启动基因功能－35区核心序列序列长度－10区核心序列rpoDrpoHrpoNTTGACATCTCNCCCTTGAACTGGNA许多热休克参与氮代谢16~1813~156TATAATCCCATNTATTGCA大肠杆菌σ因子的编码基因及启动子的特征σ70σ32σ54起始52因子被启动基因功能－35区间距－10区

σ70

rpoD许多TTGACA

16~18σ32

rpoH热休克TCTCNCCCTTGAA

13~15σ54

rpoN

参与氮代谢

CTGGNA

6因子被启动基因功能－35区53RNA合成的终止真核生物中转录终止过程仍不清楚，在E.coli染色体DNA中已知的至少有两种终止信号：1、具有转录成自身互补序列的区域，它能在RNA链末端之前15~20个核苷酸为中心处形成一个发夹式结构，该结构能够的形成能打断转录复合物中的RNA-DNA杂交部分，使RNA从整个复合物解离。不依赖于ρ因子的终止子有两个特性：①依赖于ρ因子(蛋白质)的终止子；②不依赖于ρ因子的终止子。RNA合成的终止真核生物中转录终止过程仍不清楚，在E.col542、由模板链上polyA转录而成的RNA3′端具有polyU序列RNA-polyU与DNA-polyA结合很不稳定，很容易从模板DNA上解离而终止合成。CCCACACCCGGCGCCTAATGAGCGCCGATTTTTTTTGGGTGTGGGCCGCGGATTAGTCGCGGCTAAAAAAA3355回文结构富含GC区模板链转录方向UUUUUUUUpolyUAAUUGAC3'OH5'富含G∶CCGCGGCGCGCCGCCA发夹结构ACUGAGGA非polyUAAUUGAC3'OH5'不富含G:CAGAUGAUCUACUCCA发夹结构不依赖于ρ因子的终止信号转录的RNA依赖于ρ因子的终止信号转录的RNA富含AT区2、由模板链上polyA转录而成的RNA3′端具有polyU555'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5'不依赖于ρ因子的终止信号终止过程UUUUUU不依赖于ρ因子终止信号中的polyU与模板结合疏松，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于ρ因子的终止信号则没有polyU，因此需要ρ因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。ρ因子能沿着RNA从5'3'滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。UUUUUU5'3'AAAAAAU3'5'AAAAAAUUUUUU3'5565'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'5'依赖于ρ因子的终止信号终止过程不依赖于ρ因子终止信号中的polyU与模板结合疏松，会使得RNA与模板结合不牢固很容易从复合体解离。依赖于ρ因子的终止信号则没有polyU，需要ρ因子帮助才能使合成的RAN从核心酶上脱落。ρ因子能沿着RNA从5'3'滑动至核心酶中心，使合成的RNA从模板上解离。GCUAUC5'3'CGATAGG3'5'CGATAGGCUAUC3'557第二节真核生物核的RNA合成负责核糖体rRNA18S、5.8S、28S的前体合成1.全酶结构比原核生物的复杂，起始因子(σ因子)种类多；2.已发现的有聚合酶有三种；合成过程与原核细胞基本相同；3.线粒体中具有不同于原核生物中的RNA聚合酶(小分子)。一、真核生物RNA聚合酶特点主要功能ⅠⅡⅢ-1RNApolase合成mRNA前体及大多数snRNA合成5srRNA前体和一些小RNA前体存在核仁核质核质Ⅲ-2合成tRNA前体核质第二节真核生物核的RNA合成负责核糖体rRNA18S、558二、真核细胞与原核细胞转录主要区别1.真核细胞中RNA聚合酶为聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并具有高度的分工，不同的聚合酶负责合成不同的RNA。2.真核细胞启动子比原核细胞启动子更复杂和更多样性，不同的RNA聚合酶能识别不同的启动子。RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别识别Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类启动子。RNA聚合酶Ⅱ识别的Ⅱ类启动子主要包括4个部位：碱基大多数为A-T碱基对－25区富含AT的7个核苷酸。类似于原核启动子－10区的Pribnow。－75区的共有序列:GGNCAATCT，其中N为C或T。－100或更远的、增强转录速率的短在序列。转录起始部位:TATA框(TATAbox):CAAT框(CAATbox):增强子(enhancer):二、真核细胞与原核细胞转录主要区别1.真核细胞中RNA聚合酶59RNApolaseⅡ合成mRNA前体及大多数snRNA核质真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子结构调节序列TATAAA起始位点5'3'GGCCAATCT+1区起始位点上游或下游附近特殊的序列启动子-75区-25区3.原核细胞靠RNA聚合酶本身识别启动子，而真核细胞的RNA无法识别启动子，要靠转录因子(transcriptionfactor,TF)识别启动子。RNApolaseⅡ合成mRNA前体及大多数snRNA核60转录因子(transcriptionfactor,TF)是指参与转录起始有关的一类功能蛋白质。转录因子的功能是与启动子结合，通过蛋白质与蛋白质的相互作用，将RNA聚合酶锚于启动子处，促进基因转录。真核细胞转录因子对应于RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，分别称为TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ。其中TFⅡ种类较多，功能复杂，但研究也较深入。现在已经发现的TFⅡA、TFⅡB、TFⅡC、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH、TFⅡJ等。TF(transcriptionfactor)的功能:TF(transcriptionfactor)的种类:TFA-J是能识别结合TATA序列附近的蛋白质因子，称为通用转录因子(generalfactors,GTF)，或称为基本转录因子(basaltranscription)。转录因子(transcriptionfactor,TF)61通用转录因子(basaltranscriptionalactivators)可以与启动子附近或远离启动子的顺式原件结合，调控转录起始复合物的组装过程。这些因子有明显的DNA结合域和激活转录所需要的激活结构域。启动子特异转录激活因子(promoter-specfictranscriptionalactivators)通用基因转录准确起始必须因子，即在一般情况下他们都参与基因组成性表达。通用基因：糖一般代谢、脂类一般代谢、蛋白质一般代谢所有酶等蛋白质的编码基因。这些特异性转录因子在受生物胁迫(病源菌侵入)或非生物胁迫(热击、冷害、干旱、重金属毒害)时，才会调节和控制某些基因表达。即调控基因上游应答元件，如热击应答元件(heatshockresponseelement,HSE)、金属应答原件(metalresponseelement，MRE)等。通用转录因子(basaltranscriptionala62TATA(关键亚基TBP)框结合蛋白与TFⅡD结合，稳定TFD与TATA结合桥连蛋白:是TBP与TFⅡF-polⅡ结合的桥梁真核polⅡ在转录因子作用下形成转录起始复合物过程:5'3'TATAAA起始位点GGCCAATCTTFⅡD(TBP)TFⅡATFⅡBTFⅡHTFⅡJpolⅡTFⅡFTFⅡETATA(关键亚基TBP)框结合蛋白与TFⅡD结合，稳定TF63真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录过程所需的转录因子组成及功能转录因子亚基数Mr(kd)功能起始阶段RNA聚合酶Ⅱ1210~22催化RNA合成TBP（TATA盒138专门识别TATA盒子结合蛋白）TFⅡA312，19，35稳定TFⅡB和TFP对启动子的结合TFⅡB135结合于TFP；组装PolⅡ-TFⅡF复合物TFⅡD1215~25能与正调节、负调节蛋白相互作用TFⅡE234，57组装TFⅡH；ATP和解旋酶活性TFⅡF230，74紧密结合于PolⅡ，结合TFⅡB，防止RNA聚合酶结合于非特异DNA顺序TFⅡH1235~89启动子DNA解螺旋，磷酸化RNA聚合酶，组装核苷酸切割修复复合物；真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录过程所需的转录因子组成及功能转录因64顺式作用元件(cis-actingelement)，亦称应答元件(responseelement)。这些元件包括启动子、增强子(enhancer)、和沉默子(silencer)等。4.真核生物的转录受许多特定的顺式作用元件(cis-actingelement)和反式作用因子(trans-actingfactors)的影响。顺式作用元件的本质是存在启动子附近的短在DNA特有序列，对于转录启动和调控产生影响的核苷酸序列。顺式作用元件TATAAA起始位点-25区TATA盒子能控制转录的忠实性。5'3'GGCCAATCT-75区CAAT框能决定转录的起始频率。+1区调节基因表达活性决定启动频率也决定打开或沉默。顺式作用元件只有与反式作用因子(特有蛋白质)结合才能对转录启动频率或速度产生影响。下游上游顺式作用元件(cis-actingelement)，亦称应65增强子增强子(enhancer)位于上游，距离起点至少100bp以上，是一种远程控制元件，又称为上游激活序列(upstreamactivatorsequence,UAS)，它通过启动子来增强转录频率。增强子区由8～12bp的“核心”元件组成，共有序列为：TGGAAAG/TA/TA/T增强子结构一般特点:一般具有完整或部分回文序列结构，并以单拷贝或多拷贝的形式存在；通常距离+1区1～4kb，甚至在+1区的3kb之外起作用。增强子增强子(enhancer)位于上游，距离起点至少10066近年来已经证明，UAS通过以下方式起作用：影响超螺旋密度，使DNA双螺旋弯曲，改变模板的整体结构，便于转录起始。通过增强子可把模板固定在细胞内特定的位置，如连接在核基质上，以利于拓扑异构酶改变DNA双螺旋的张力，促进RNApolyⅡ在DNA链上结合滑动。可为RNApolyⅡ或其他重要蛋白质因子提供与染色质结合的“进入位点”。近年来已经证明，UAS通过以下方式起作用：影响超螺旋密度，67第三节转录后加工一、原核生物转录后加工原核生物mRNA一经转录不需要加工、修饰就具有模板活性，但是tRNA和rRNA的原初转录产物均需要经过一系列加工，才能成为活性分子。主要包括剪切、剪接形成5'-端和3'-端的特殊结构、碱基修饰、改变糖苷酸等过程。1.原核rRNA前体的加工E.Coli的rRNA前体分子沉降系数为30S(P30)，大约含6300个核苷酸残基。需要经过修饰、剪切、剪接形成16SrRNA、23SrRNA和几个tRNA。整个过程可以简单图示如下：第三节转录后加工一、原核生物转录后加工原核生物mRNA6816SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1)甲级化作用(2)RNaseⅢⅢⅢⅢ(3)RNaseEEE剪切16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNAP16Per-tRNAP23P530SRNA专一核酸酶内切酶甲级化常见形式2'-甲级核糖16SrRNA特有甲级化N4,2‘-O-甲级胞嘧啶(m4Cm)16SrRNA23SrRNA4StRNA5SrRNA(1692.原核tRNA前体的转录后加工E.Coli染色体基因组共有tRNA的基因约60个，除少数几个与rRNA一起转录，其余的大多数成族排列，转录成含两个或多个tRNA的前体，再进行加工。tRNA前体加工包括：①核酸内切酶剪切；②核酸外切酶从3'-端逐个切去附加顺序，进行修剪；③在tRNA3'-端添加CCCA-3'OH；④核苷酸的修饰和异构化。RNase与DNA内切酶不同，RNase不能识别特异序列，它所识别的是加工部位的空间结构。Per-tRNA加工、修饰工程简图示意如下：2.原核tRNA前体的转录后加工E.Coli染色体基因组共有70RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseFRNaseD异构化酶异构化酶CCA3'-OHCCA3'-OHtRNA前体加工过程中的核酸内切酶RNaseP能切出成熟5'-端的内切酶RNaseF加工tRNA3'-端的核酸内切酶RNaseDtRNA3'-端成熟的核酸外切酶tRNA核苷酰基转移酶per-tRNACCA3'-OH5'加工修饰RNasePRNaseFRNaseDRNasePRNaseF71二、真核生物转录后的加工1.前体mRNA的加工原核生物大多数是含有几个遗传信息的多顺反子mRNA，仅有少数为单顺反子mRNA，由于转录与翻译过程偶联所以大多数原核生物mRNA大多不需要加工就直接进入翻译阶段。只有少数多顺反子mRNA需要加工，即需要剪切成小单位后，再进行翻译。真核生物的基因在DNA上是间隔排列的，这称为断裂基因。但是转录时间隔部分是被一起转录成前体RNA，必须经过剪切和剪接以除去内含子序列，转变成成熟的mRNA后，才能进一步实施后续的蛋白质翻译。3'-端添加polyA，5'-端戴帽，碱基甲级化修饰等。二、真核生物转录后的加工1.前体mRNA的加工原核生物大多数72mRNA初级转录本转录过程中或完成后在核内进行5'端加帽子外显子内含子外显子m7Gppp核内3'端加多聚A尾，胞质中也有相应酶系，还可以继续延长尾巴m7GpppAA(A)Na-OHmRNA前体剪切去除内含子，拼接外显子m7GpppAA(A)aA-OH转运核质胞质可翻译的mRNAm7GpppAA(A)aA-OH成熟的mRNA核膜孔甲基化，RNA编辑mRNA初级转录本转录过程中或完成后在核内进行5'端加帽子外732.前体rRNA加工rRNA基因是多拷贝的，如原核生物基因中rNRA基因有5～10拷贝；真核生物中rNRA拷贝数更多，如果蝇为260拷贝。而且rRNA基因是由非转录区(