生化技术（5）化学检测课件

第五章化学检测技术1、生化检测技术定义：根据物质的各种性质对物质进行定性、定量、定位测定的各种方法。2、化学检测定义：根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法。第一节糖类的化学检测1、糖类有单糖、双糖、寡糖和多糖之分，单糖和某些双糖是具有多羟基醛或多羟基酮（即羰基化合物）。其中具有（CH2O）n通式的为还原糖。多糖和蔗糖为非还原糖。2、糖类的化学检测主要是利用糖结构中游离羰基的还原性，与氧化剂试剂进行氧化还原反应而进行测定的。而对于非还原性糖必须转化成还原性糖再进行测定。第五章化学检测技术1、生化检测技术定义：根13、糖类化学检测中最常用的试剂为斐林（Fehling)试剂。1）其基本组成是2）Fehling试剂测定原理根据一定量的Fehling试剂完全还原，所需还原糖的量，计算样品中还原糖的含量。酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应。还原糖在碱性条件下将金属络离子（铜、汞、银等）还原，而还原糖本身被氧化成酸类化合物，此性质可作为还原糖含量测定的依据。因为含有游离羰基的糖类，-CHO具有还原性，而硫酸铜作为一种氧化剂与糖类作用时，糖类的-CHO被氧化，两价的铜离子被还原成氧化亚铜。测定氧化亚铜的生成量即可测知溶液中的含糖量。常用的Fehling试剂和Benedict试剂就是CuSO4的碱性溶液。3、糖类化学检测中最常用的试剂为斐林（Fehling)试剂。2一、兰-爱农（Lane-Eynon）法1、以次甲基蓝为指示剂，直接用糖溶液滴定到Fehling试剂中进行测定的方法或将糖溶液加到Fehling试剂中，再用标准的葡萄糖反滴定2、用Lane-Eynon法滴定还原糖时，应在电炉上加热至微沸，整个过程应在3min内完成（为什么？）反应取决于反应液的碱度及加热的时间和温度（1）尽量减少生成的Cu2O被空气中O2重新氧化（2）减少还原糖未与Cu2+反应前已被氧化成糖酸3、多糖或其他非还原糖必须转化成还原糖后才能进行还原滴定。如：淀粉还原性单糖进行Fehling试剂测定。酸或碱水解酶法水解中和或微酸性一、兰-爱农（Lane-Eynon）法1、以次甲基蓝为指示剂3二、斐林试剂快速法是在Fehling试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）K4Fe(CN)6红色Cu2O与亚铁氰化钾络合生成可溶性的复盐使反应终点更为明显。三、碘量法将过量的二价铜用碘化钾还原，析出的碘用硫代硫酸钠滴定即为碘量法。包括次碘酸钠法和铜试剂法。1、次碘酸钠法是以I与NaOH反应生成的次碘酸钠（NaIO)去氧化还原糖的自由醛基，过量的I2再由Na2S2O3滴定，而进行糖的测定。由于次碘酸钠的氧化能力较弱仅适用于醛糖的滴定，而与酮糖不起反应。（所以在酮糖存在的情况下，可以单独测定醛糖）二、斐林试剂快速法是在Fehling试剂中加入亚铁氰化42、酮试剂法是将还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜用碘氧化，再用Na2S2O3滴定反应液中剩余的碘，而测定样品中还原糖的含量。另外对于葡萄糖的测定还可用以下方法：（1）铁氰化钾方法在热碱溶液中，葡萄糖可将黄色的高铁氰化钾还原成无色的亚铁氰化钾，致使λ=420nm的吸光度降低，而降低的程度与样品中葡萄糖浓度成正比。稀释样品透析器葡萄糖与高铁氰化钾混合油浴（95℃）的蛇形管高铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾测λ=420nm的吸光度计算葡萄糖的浓度。流经透析出流经加热此法可用于连续流动分析仪测定样品中葡萄糖的含量。2、酮试剂法是将还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜5（2）邻甲苯胺法利用某些芳香伯胺可与醛糖在热醋酸中生成有色化合物的原理。首先，邻甲苯胺试剂与醛糖的醛基缩合形成糖基胺和其Shiff碱的平衡混合物；然后经分子重排等反应生成蓝绿色化合物。在λ=630nm处有一吸收峰，吸光度大小与葡萄糖浓度成正比。（3）3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）糖类的测定在工业发酵以及微生物培养中具有特别的重要意义。如原料中淀粉含量是原料的重要质量指标；发酵过程中糖量变化可以衡量发酵正常与否；味精生产中终了也需通过发酵液中残糖的测定确定的。另外，淀粉酶、糖化酶的活力测定也是通过测定糖量来计算的。三、应用（2）邻甲苯胺法利用某些芳香伯胺可与醛糖在热醋酸中6

※谷氨酸发酵液中还原糖的测定在谷氨酸发酵中有着重要的指导意义。还原糖的变化与发酵正常与否、染菌与否关系密切。同时，发酵完毕和放罐时间也是通过残糖测定来确定的。一般情况下，染菌后，还原糖几乎不被减少；而正常发酵中，当还原糖小于1%时就可认为发酵完毕放罐。※谷氨酸发酵液中还原糖的测定在谷氨酸发酵中有着重要的7第二节蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质是由二十种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，而测定蛋白质一般是利用蛋白质的结构或性质进行的1、蛋白质的肽链结构。如双缩脲反应2、酪氨酸和色氨酸对Folin-ciocalteu(酚）试剂反应或紫外吸收。如紫外分光光度法测定法。3、与色素结合的能力。如考马斯亮蓝染色法。4、沉淀后借浊度或光折射测定。一、凯氏定氮法测定蛋白质的含量（总蛋白测定）1、依据：蛋白质是含氮化合物且含氮量几乎是恒定的，平均为16%，故只要测出蛋白质的含量，再乘以6.25即为蛋白质的含量。第二节蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质是由二十种82、原理：用高温、浓硫酸将蛋白质消化，使其所含的氮素全部转化为铵盐，在加碱使碱盐成为氨经蒸馏分离出来，最后用酸滴定测定氮量。按每克氮相当于6.25克蛋白质计算蛋白质的量。消化炉++消化管漏斗蛋白质RCH(NH2)COOHCO2、NH3、SO2、H2O浓硫酸浓硫酸200℃200℃NH3+H2SO4（过量）

(NH4)2SO4(NH4)2SO4+NaOHNa2SO4+2NH3+H2ONH3+H3BO3(NH4)3BO3(NH4)3BO3+HClH3BO3+NH4ClHCl+NaOHNaCl+H2O2、原理：用高温、浓硫酸将蛋白质消化，使其所含的氮素全部转化9★在消化过程中添加的各种试剂的作用（1）浓硫酸：脱水使有机物炭化、氧化，浓硫酸在200度以上能使有机物破坏生成二氧化碳和水。（2）硫酸铜：作为消化的催化剂以促进化学反应的进行。（3）硫酸钾或硫酸钠等：用于提高消化时的沸点，可使沸点提高到400℃。（4）浓碱：可使消化液中的(NH4)2SO4分解游离出氨。★样品的预处理（1）固体样品中含氮量是用100克该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。定氮前应先将固体样品中的水分除去，一般样品的烘干温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。（2）若为液体样品，可直接量取一定体积的样品进行测定。★在消化过程中添加的各种试剂的作用（1）浓硫酸：脱水使有机物10二、双缩脲试剂法测定蛋白质的含量。蛋白质中的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合生成的双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）在碱性条件下与铜离子作用形成紫红色的反应相似故称为双缩脲反应。这种颜色反应强度在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比关系，经与同样处理的蛋白质标准溶液比较，即可求得蛋白质含量，此用于蛋白质的定量测定。定性测定：双缩脲反应至少含有两个-CO-NH-基团才能和铜离子络合，故氨基酸及二肽无此反应，三肽以上才能进行反应。可以通过此反应检查蛋白质的水解程度。但含有两个-CSNH-、-C（NH）NH-或CH2NH-等基团的化合物对双缩脲试剂反应亦呈阳性，所以本反应并非蛋白质所特有。二、双缩脲试剂法测定蛋白质的含量。蛋白质中的肽键（-11三、Folin-ciocalteu(酚）试剂法测定蛋白质含量此法Folin最早用于酪氨酸和色氨酸的测定，后由我国吴宪用于蛋白质定量测定，经多次改良成广泛应用的Lowry法，是对双缩脲的发展。蛋白质先与碱性硫酸铜（含酒石酸钾钠）作用。其肽键或烯醇化的肽键可与铜离子络合，络合物释放出电子，使后加入的酚试剂（主要成分为磷钨酸和磷钼酸）还原。

另一方面，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸也能使钨酸、钼酸或两者同时失去氧原子，还原成多种有蓝色的混合酸。最大的吸收峰在λ=745~750nm。一般可在650nm处比色测定。-N-C-HO=-N=COH-N-C-=O与Cu2+络合后释放出电子磷钨酸、磷钼酸蓝色混合酸此法的灵敏度为10~60μg/ml三、Folin-ciocalteu(酚）试剂法测定蛋白质含12此外蛋白质的测定方法还有：（1）紫外分光光度法许多蛋白质由于含有色氨酸和酪氨酸，在λ=280nm处有一吸收峰，可用于测定蛋白质的含量。但生物样品常混有核酸，而核酸的最大吸收峰λ=260nm处，在λ=280nm处也有较强的光吸收峰，可采用两个波长测定吸光度校正。用各种蛋白质和核酸不同比例的混合样品求得的各种经验公式，可以算出蛋白质浓度1）Lowry-kalacker公式蛋白质浓度（mg/ml)=1.45A280-0.74A2602)Warburg-christian公式蛋白质浓度（mg/ml)=1.55A280-0.76A260本法测定的蛋白质未加任何试剂和处理，可保留样品的生物活性，且可回收全部蛋白质，故常用于较纯的酶和免疫球蛋白等蛋白质含量的测定。此外蛋白质的测定方法还有：（1）紫外分光光度法许多蛋白13（2）染料结合法

在酸性条件下，蛋白质分子解离出带正电荷的-NH3+基团，它可与染料的阴离子产生颜色反应。借以同样处理的标准溶液对比，求出样品中蛋白质的含量。最常用的染料为考马斯亮蓝G-250，在酸性条件下，与蛋白质结合后由棕红色变为蓝色，最大吸收峰从465nm移至595nm，在150mg/dl范围内蛋白质浓度和吸光度成线性关系。（3）比浊法某些强酸如三氯乙酸、磺基水扬酸或两者混合等，能与生物碱结合而沉淀故称为生物碱试剂，它们能与蛋白质结合产生沉淀。这是蛋白质的共性，即在pH小于蛋白质等电点的溶液中，蛋白质分子带正电荷，可与带负电荷的三氯乙酸或磺基水扬酸结合形成沉淀。然后测定悬浮液的混浊度，与同样处理的已知含量的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量（2）染料结合法在酸性条件下，蛋白质分子解离出带正14四、蛋白质N-末端氨基酸DNS测定法即丹磺酰化测定法（二甲氨基萘磺酰氯法）（DNS-Cl）1、原理DNS-Cl是一种荧光试剂，能与蛋白质（或多肽）的N-末端氨基酸反应生成DNS-多肽，DNS-基团与N-末端氨基酸反应结合牢固，水解可得DNS-氨基酸和各种氨基酸。用醋酸乙酯抽提，然后进行层析法鉴定，层析图谱在360nm或280nm出产生强烈的荧光，与标准样品对照测知蛋白质或多肽的N-末端氨基酸，从而确定蛋白质多肽链的数目。2、反应过程DNS-Cl+蛋白质（多肽）DNS-蛋白质（多肽）DNS-氨基酸+各种氨基酸醋酸乙酯抽提碱性条件PH9.1（H+）酸性水解H2O四、蛋白质N-末端氨基酸DNS测定法即丹磺酰化测定法（二甲氨15五、蛋白质氨基酸排列顺序的测定-Edman法又称PITC法（异硫氰酸苯酯分析法）1、原理蛋白质或多肽的N-末端氨基酸能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰蛋白质或多肽，简称PTC-蛋白质或多肽，它们在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）并从肽链上水解下来，少一个N-末端氨基酸的多肽链保持完整，因为PITC的引入只使N-末端第一个肽键稳定性降低。PTC-氨基酸经有机溶剂抽提，进行层析鉴定并与标准样品对照从而测定出样品中N-末端氨基酸种类。剩余的多肽可再与PITC重复上述反应，逐步递减N-末端氨基酸，确定其顺序，称为Edman顺序降解法。五、蛋白质氨基酸排列顺序的测定-Edman法又称PITC法（162、反应过程PITC+蛋白质（多肽）PTC-蛋白质（多肽）PTH-氨基酸+少一个氨基酸的剩余多肽PH8.7~9.040-50℃H+H2O☆蛋白质多肽链氨基酸顺序测定的步骤（3）通过N-末端氨基酸的测定，确定蛋白质多肽链的数目（1）蛋白质进行提取、纯化。（2）断裂多肽链的二硫键并进行拆分多肽链。（4）利用Edman法测定各肽链氨基酸的排列顺序。☆几种水解断裂多肽链酶的介绍（1）胰蛋白酶：专一水解赖氨酸和精氨酸的羧基参与形成的肽键（2）糜蛋白酶：断裂苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键（3）胃蛋白酶断裂Leu、Phe、Trp和Tys等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键另、CNBr只断裂甲硫氨酸羧基参与形成的肽键。2、反应过程PITC+蛋白质（多肽）17六、蛋白质N-末端氨基酸FDNB测定法1、原理蛋白质或多肽的游离末端-NH2与DNFB（2，4-二硝基氟苯又称Sanger试剂）反应，生成DNP-蛋白质（多肽），由于DNFB与氨基形成的键对酸水解稳定性比肽键高，因此当DNP-蛋白质（多肽）经酸水解时，只有N-末端氨基酸为黄色的DNP-氨基酸衍生物，其余为游离的氨基酸，只要鉴别DNP-氨基酸即可得知N-末端的氨基酸。由于DNFB的衍生物DNP-氨基酸都呈黄色，有利与检测但它们对光敏感，因此应避光进行实验。2、注意六、蛋白质N-末端氨基酸FDNB测定法1、原理蛋白质18七、茚三酮显色法测定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸以及一切蛋白质都能与以上同反应生成蓝紫色物质茚三酮反应分为两步进行：首先，氨基酸氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被氧化成还原型的茚三酮；其次，还原型的茚三酮铜另一水合茚三酮分子和氨缩合成有色物质。β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应，因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮颜色反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸，在定性定量测定试验中应严防干扰物的存在。七、茚三酮显色法测定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羟脯19八、本身没有颜色的物质，通过适当的试剂反应，转化为有颜色的物质，如双缩脲反应、茚三酮反应和荧光反应等。如：荧光检测技术可分为原子荧光检测技术和分子荧光检测技术荧光检测的方法有三类：1）直接用荧光性物进行检测；2）利用非荧光物与荧光试剂进行反应，成为荧光性物质，再进行检测；3）在荧光性物质中加入消光物质，测定荧光的减少量。（一）邻苯二甲醛荧光法测定氨基酸邻苯二甲醛（OPT）作为一种荧光试剂，主要用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测方法。八、本身没有颜色的物质，通过适当的试剂反应，转化为有颜色的物20OPT+氨基酸、多肽和蛋白质荧光性化合物碱性还原剂激发波长为λ=340nm,荧光波长λ=455nm优点：OPT与氨基酸、多肽等反应不需加热、作用迅速、荧光试剂与氨基酸混合后5min便可测定荧光，灵敏度高荧光产物有一定稳定性。。（二）荧光胺荧光分析法测定肽的含量以荧光胺为荧光试剂，用于蛋白质、肽、氨基酸等的检测方法。其中合成类似的荧光试剂MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。荧光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白质等）生成强荧光性化合物PH=8-9其激发波长为λ=390nm,荧光波长λ=475nmOPT+氨基酸、多肽和蛋白质21九、甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质在水溶液中存在如下平衡：不能用一般的酸碱指示剂氨基酸在高PH的水溶液中能发生下面的解离反应：R-CH-COO-R-CH-COO-+H2O-NH3+-NH2OH-九、甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质在水溶液中存在如下22-NH3+是一个弱酸，使其完全解离时PH为11-13，若用碱滴定-NH3+所释放的H+来测定氨基酸，一般指示剂变色范围小于10，很难准确指示终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物R-CH-COO-R-CH-COO-+H+

-NH3+-NH2NaOH中和HCHO中性条件R-CH-COO-NHCH2OHR-CH-COO-N（CH2OH）2HCHO中性条件利用化学平衡原理，由于醛基的加入，使平衡右移，促使-NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色范围内（PH9.0）左右。此时可用酚酞作为指示剂，用标准NaOH溶液滴定。-NH3+是一个弱酸，使其完全解离时PH为11-1323

第三节蛋白质的免疫化学检测定义：利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析的技术。一、基本概念与原理1、抗体：将外源物质（不同种属的蛋白质或微生物）不经口（避开消化道）进入动物体内后，经过一定时间，动物的血清中出现与引入蛋白质起反应的物质（球蛋白）。2、抗原：能引起抗体产生的物质3、免疫反应：抗原与抗体起结合反应，形成沉淀的过程。二、蛋白质的免疫化学检测方法主要有凝集反应和沉淀反应（一）凝集反应1、定义：细胞性抗原（细菌、病毒、红血球等）与相应的抗体（抗血清）相混合时，细胞性抗原出现凝集成团，这叫做凝集反应。2、用途测定抗体（抗血清）的效价，也可用于细菌、病毒的分类。第三节蛋白质的免疫化学检测定义24（二）沉淀反应1、定义：可溶性抗原（蛋白质）与相应的抗体混合，当两者的比例适当，并有适当的盐类存在时，即可形成沉淀。这叫沉淀反应。2、注意条件1）选择适当的抗原、抗体比例9ml9ml9ml9ml9ml取1ml取1ml取1ml取1ml原液稀释10-1倍稀释10-2倍稀释10-3倍稀释10-4倍如果是药品则以稀释倍数的倒数为该药品的效价。假如青霉素在10-4稀释倍数时能全部杀死某种病毒，则此时青霉素对这种病毒的效价为10000个单位。（二）沉淀反应1、定义：可溶性抗原（蛋白质）与相应的抗体混合252）沉淀温度：一般为37℃或室温（25℃）3）沉淀PH：一般为中性偏碱（PH6.5~8.6)4)离子强度：一般为生物的生理盐水浓度0.9%NaCl溶液3、作用：可对抗原和抗体进行定性、定量测定。4、方法1）沉淀试验利用抗体+抗原沉淀为阳性反应2）界面试验抗体抗原（不同浓度）沉淀界面注：在实验中应利用生理盐水作空白对照实验。2）沉淀温度：一般为37℃或室温（25℃）3）沉淀PH：一般263）免疫扩散利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原与抗体在浓度比例合适的部位产生沉淀带或沉淀环，从而检测蛋白质。★单向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中。当抗原适当过量时，便可形成沉淀带。抗体血清半固体基质扩散作用抗原沉淀带3）免疫扩散利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗27★双向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中。当抗原适当过量时，便可形成沉淀带。抗体抗原扩散作用沉淀带抗血清不同蛋白质溶液★双向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中284）免疫电泳123456123456代表不同的抗血清扩散电泳技术与免疫扩散相结合。4）免疫电泳123295）免疫亲和层析抗原和相应的抗体具有特异亲和力的生物分子对。6）免疫荧光检测技术第四节核酸的化学检测核酸磷酸+戊糖+碱基，针对核酸不同组成，可采取定磷法、二苯胺法和地衣酚法对它们进行化学检测。水解一、定磷法测定核酸含量可用于分析生物材料或制品中核酸、核苷酸所含的磷成分。

其过程为：先将核酸或核苷酸用强酸消化（如浓硫酸或过氯酸），使有机磷转化成无机磷；再用一般测定无机磷的试剂显色，如用钼酸铵与无机磷反应而生成蓝色的磷钼酸；最后根据无机磷的含量推算核酸或核苷酸的含量。5）免疫亲和层析抗原和相应的抗体具有特异亲和力的生物分子对。30蓝色的磷钼酸最大吸收峰在650~660nm波长处，测定OD650，测定磷的含量。二、二苯胺法测定DNA含量（比色法）为测定脱氧核糖的常用方法含脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。在595nm处有最大吸收峰。因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮醛戊醛。它再与苯胺作用产生蓝色物质，在一定范围内与DNA的浓度成正比。由于DNA和RNA都含有磷，所以在测定时必须把两者分开，然后分别进行测定。DNA+少量浓H2SO4+二苯胺蓝色物质100℃蓝色的磷钼酸最大吸收峰在650~660nm波长处，测31三、地衣酚法测定RNA含量（比色法）测定核糖的常用方法是苔黑酚（即地衣酚：3.5-二羟甲苯法）当含有核糖的RNA与浓HCl及3.5-二羟甲苯法）在FeCl3存在的情况下反应，在沸水浴中加热10-20分钟后，有绿色物质产生，这是RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3.5-二羟甲苯作用产生绿色物质，在670nm处有最高吸收峰，在一定浓度与RNA成正比。RNA+浓HCl+3.5-二羟甲苯法）绿色复合物100℃FeCl3实际上在酸溶液中，DNA与RNA的嘌呤核苷键易水解断裂而产生具有戊糠醛基的水解产物，称为去嘌呤核酸，后者可在酸中进一步变成糠醛衍生物，再与特异的试剂呈现颜色反应。由此可测定生物材料或制品中核酸的含量。三、地衣酚法测定RNA含量（比色法）测定核糖的常用方法是苔黑32四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，对260nm的紫外吸收波有一个最大的吸收，根据此性质可进行定性和定量测定。方法是：在260nm处测定样品的吸收度，然后与标准曲线对比，即可求出样品的核酸含量。此法的优点是：不易受其他物质的干扰、灵敏度高、正确而迅速。

核酸测定时应注意：用测糖法和测磷酸法来测定生物样品中核酸或其水解产物的含量时，一般需去掉干扰物质，如磷蛋白、糖类、磷脂和辅酶等杂质。四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤碱和嘧啶碱具有33第六章光学检测技术定义：利用物质所具有的各种光学性质，或被检测物与其他物质进行颜色反应后，进行光学检测，对物质进行定性和定量及结构分析的技术。第一节旋光检测技术1、定义：2、原理：手性分子具有旋光性。即分子中具有不对称碳原子的物质如糖类、多数氨基酸、羟基酸等，能够使偏振光的偏振面产生旋转作用即旋光作用。旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度，旋光度的大小和方向可用旋光仪测定。第六章光学检测技术34物质的旋光度主要决定于物质本身的结构，同时与溶液的浓度、溶剂、温度、样品管的长度和光的波长有关系。物质的旋光度α为α=[α]λt.L.C/100通常采用比旋光度[α]λt.来表示各种物质的旋光度[α]λt.=100a/LC如20℃时，利用旋光仪测定谷氨酸水溶液的旋光度，2dm的样品管，测得α=+10.6，求谷氨酸的浓度。物质的旋光度主要决定于物质本身的结构，同时与溶液的35第二节荧光检测技术荧光检测技术可分为原子荧光检测技术和分子荧光检测技术1、原理：分子荧光的发生是物质分子吸收辐射能，从基态（低能级）跃迁至某一电子激发态中（较高能级）的某一振动能级。处于受激发态较高的振动能级中的分子通过运动或与其他分子碰撞而将过多的能量转移给其他分子，很快回到第一激发态的最低振动能级，然后发生自发辐射跃迁到基态，发射出一定波长的辐射能量，此能量即为荧光。第二电子激发态S2第一电子激发态S1基态S0碰撞失去振动能荧光不同的物质放射的荧光光谱不同，荧光的强度与物质的浓度有关。第二节荧光检测技术362、荧光检测的方法有三类：1）直接用荧光性物进行检测；2）利用非荧光物与荧光试剂进行反应，成为荧光性物质，再进行检测；3）在荧光性物质中加入消光物质，测定荧光的减少量。一、邻苯二甲醛荧光法测定氨基酸邻苯二甲醛（OPT）作为一种荧光试剂，主要用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测方法。OPT+氨基酸、多肽和蛋白质荧光性化合物碱性还原剂激发波长为λ=340nm,荧光波长λ=455nm优点：OPT与氨基酸、多肽等反应不需加热、作用迅速、荧光试剂与氨基酸混合后5min便可测定荧光，灵敏度高荧光产物有一定稳定性。。2、荧光检测的方法有三类：一、邻苯二甲醛荧光法测定氨基酸37二、荧光胺荧光分析法测定肽的含量以荧光胺为荧光试剂，用于蛋白质、肽、氨基酸等的检测方法。其中合成类似的荧光试剂MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。荧光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白质等）生成强荧光性化合物PH=8-9其激发波长为λ=390nm,荧光波长λ=475nm二、荧光胺荧光分析法测定肽的含量以荧光胺为荧光试剂，38第三节分光光度检测技术分光光度检测是利用物质所特有的吸收光谱来鉴定物质或测定物质含量的技术。根据物质吸收光谱的频率范围不同，分光光度分析可分为：紫外光（200-400nm）检测核酸类、蛋白质类等。可见光（400-760nm）各种有色物质。红外光（760-10000nm）饱和脂肪酸、脂肪胺、醇类等一、样品溶液的配制1、物质本身对紫外光、可见光或红外光等有选择吸收特性的物质。2、本身没有颜色的物质，通过适当的试剂反应，转化为有颜色的物质，如双缩脲反应和茚三酮反应。第三节分光光度检测技术分光光度检测是利用物质所特有的吸收39二、样品的检测根据被测物的吸收光谱特性，选择好入射光线的波长，调节好零点，即可进行测试。三、待测物质的定性分析（确定为何种物质）1、将测得的吸收光谱与标准物质的吸收光谱相对照。2、根据吸收光谱中峰顶与峰谷吸光度之比值与相当条件下资料所记载的比值相比较，推断为何种物质。3、分光度检测技术与其他生化技术相配合。四、待测物质的定量分析1、根据Lambert-Beer定律（光吸收的基本定律）由于有机化合物中发色基团和助色基团的种类、数目及其在分子中所处的位置和环境不同，因此测得的吸收光谱也不相同，依据物质的吸收光谱的特性和形状，可作该物质的鉴别、纯度检查和初步结构分析等。二、样品的检测根据被测物的吸收光谱特性，选择好入射40Lambert-Beer定律是可见光、紫外光吸收光谱法定量基础。说明吸光物质对单色光吸收的强弱与该物质的浓度与厚度间关系的规律，是吸收光谱的基本定律。E=KCL其中Lambert定律，说明吸收与厚度间的关系Beer定律说明吸收与浓度间的关系。2、绘制标准曲线，测定样品与标准曲线比较或在标准曲线上查出样品中物质的含量。3、对于有干扰物质存在的样品，计算时要进行适当的校正。如：Lowry-kalacker公式蛋白质浓度（mg/ml)=1.45A280-0.74A260Lambert-Beer定律是可见光、紫外光吸收光谱法定量基41第七章气体检测技术1、气体检测技术：利用物质在生化反应或化学反应中放出或吸收气体的性质，通过测量气体量的变化而对物质进行定性和定量分析的技术。2、应用：用于细胞的呼吸、酶的反应动力学研究、氧化还原反应以及氨基酸、酮酸、尿素等的测定。3、检测的气体：主要为CO2、N2和O2气体检测有两种类型1）一种是测量试样中的气体组分如瓶装啤酒中CO2含量的测定2）另一种是固体或液体试剂经过化学反应生成某一种气体，借助气体生成量来计算被测物组分的含量。第七章气体检测技术1、气体检测技术：利用物质在生化反应424、主要应用的仪器为1）华勃氏（Warburg)呼吸仪：主要用于反应过程中氧气的吸收量或二氧化碳的放出量的测定。如：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶。只催化L-Glu脱羧，反应生成的CO2可用华勃氏呼吸仪来定量测定释放的CO2摩尔数等于溶液中谷氨酸的量HOOC-CH2-CH2-CH-COOHHOOC-CH2-CH2-CH2NH2+CO2NH2L-Glu脱羧酶2）范.斯莱（Vanslyke)检测仪：主要用于检测α-氨基酸与亚硝酸反应所产生的氮气，从而计算氨基酸的含量R-CH-COOH+HNO2R-CH-COOH+N2+H2ONH2OH通过范.斯莱定氮仪测定N2的体积，计算出N2的摩尔数，得到α-氨基酸的摩尔数。4、主要应用的仪器为如：大肠杆菌L-谷氨酸脱羧酶。只催化L-43第一节华勃氏呼吸仪检压法一、基本原理在温度固定和体积不变的条件下，反应系统中某气体量的变化可以从其所表现的压力变化测量出来。根据理想气体状态方程PV=nRT测出压力的变化，算出气体量的变化n=PV/RT=KP华勃氏呼吸仪是根据气体定律而设计的，常用来测定一些吸收气体或释放气体的生物化学反应。如：1）琥珀酸的测定CH2-COOHCH-COOHCH2-COOHHOOC-CH+O2琥珀酸氧化酶2)谷氨酸和丙氨酸等氨基酸含量的测定（谷氨酸和丙氨酸在相应的脱羧酶的作用下产生CO2）第一节华勃氏呼吸仪检压法一、基本原理在温度固定和体443）组织或细胞的呼吸测定（氧气的吸入和二氧化碳的呼出）在生产谷氨酸发酵过程中必须经常测定发酵液中Glu的含量，借以控制适宜的工艺条件，获得较高的产率。发酵液中Glu含量的测定方法是利用专一性较高的大肠杆菌L-Glu脱羧酶，在一定温度（37℃）、一定PH值（PH=4.2）和固定容积的条件下，Glu脱羧生成CO2。3）组织或细胞的呼吸测定（氧气的吸入和二氧化碳的呼出）45第二节范.斯莱克检测仪测定α-氨基酸R-CH-COOH+HNO2R-CH-COOH+N2+H2Oα-氨基酸与亚硝酸反应生成羟基酸并放出氮气：NH2OH释放出的N2一半来自氨基酸；另一半来自亚硝酸，故应把测得的氮气体积除以2。再换算成标准状态下氮的体积，在标准状态下，1mol气体所占体积为22.4L。故可计算出样品液中氨基酸的含量。第二节范.斯莱克检测仪测定α-氨基酸R-CH-COOH46第五章化学检测技术1、生化检测技术定义：根据物质的各种性质对物质进行定性、定量、定位测定的各种方法。2、化学检测定义：根据物质的化学性质而对物质进行定性、定量测定的方法。第一节糖类的化学检测1、糖类有单糖、双糖、寡糖和多糖之分，单糖和某些双糖是具有多羟基醛或多羟基酮（即羰基化合物）。其中具有（CH2O）n通式的为还原糖。多糖和蔗糖为非还原糖。2、糖类的化学检测主要是利用糖结构中游离羰基的还原性，与氧化剂试剂进行氧化还原反应而进行测定的。而对于非还原性糖必须转化成还原性糖再进行测定。第五章化学检测技术1、生化检测技术定义：根473、糖类化学检测中最常用的试剂为斐林（Fehling)试剂。1）其基本组成是2）Fehling试剂测定原理根据一定量的Fehling试剂完全还原，所需还原糖的量，计算样品中还原糖的含量。酒石酸钾钠铜是一种氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应。还原糖在碱性条件下将金属络离子（铜、汞、银等）还原，而还原糖本身被氧化成酸类化合物，此性质可作为还原糖含量测定的依据。因为含有游离羰基的糖类，-CHO具有还原性，而硫酸铜作为一种氧化剂与糖类作用时，糖类的-CHO被氧化，两价的铜离子被还原成氧化亚铜。测定氧化亚铜的生成量即可测知溶液中的含糖量。常用的Fehling试剂和Benedict试剂就是CuSO4的碱性溶液。3、糖类化学检测中最常用的试剂为斐林（Fehling)试剂。48一、兰-爱农（Lane-Eynon）法1、以次甲基蓝为指示剂，直接用糖溶液滴定到Fehling试剂中进行测定的方法或将糖溶液加到Fehling试剂中，再用标准的葡萄糖反滴定2、用Lane-Eynon法滴定还原糖时，应在电炉上加热至微沸，整个过程应在3min内完成（为什么？）反应取决于反应液的碱度及加热的时间和温度（1）尽量减少生成的Cu2O被空气中O2重新氧化（2）减少还原糖未与Cu2+反应前已被氧化成糖酸3、多糖或其他非还原糖必须转化成还原糖后才能进行还原滴定。如：淀粉还原性单糖进行Fehling试剂测定。酸或碱水解酶法水解中和或微酸性一、兰-爱农（Lane-Eynon）法1、以次甲基蓝为指示剂49二、斐林试剂快速法是在Fehling试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）K4Fe(CN)6红色Cu2O与亚铁氰化钾络合生成可溶性的复盐使反应终点更为明显。三、碘量法将过量的二价铜用碘化钾还原，析出的碘用硫代硫酸钠滴定即为碘量法。包括次碘酸钠法和铜试剂法。1、次碘酸钠法是以I与NaOH反应生成的次碘酸钠（NaIO)去氧化还原糖的自由醛基，过量的I2再由Na2S2O3滴定，而进行糖的测定。由于次碘酸钠的氧化能力较弱仅适用于醛糖的滴定，而与酮糖不起反应。（所以在酮糖存在的情况下，可以单独测定醛糖）二、斐林试剂快速法是在Fehling试剂中加入亚铁氰化502、酮试剂法是将还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜用碘氧化，再用Na2S2O3滴定反应液中剩余的碘，而测定样品中还原糖的含量。另外对于葡萄糖的测定还可用以下方法：（1）铁氰化钾方法在热碱溶液中，葡萄糖可将黄色的高铁氰化钾还原成无色的亚铁氰化钾，致使λ=420nm的吸光度降低，而降低的程度与样品中葡萄糖浓度成正比。稀释样品透析器葡萄糖与高铁氰化钾混合油浴（95℃）的蛇形管高铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾测λ=420nm的吸光度计算葡萄糖的浓度。流经透析出流经加热此法可用于连续流动分析仪测定样品中葡萄糖的含量。2、酮试剂法是将还原糖与二价铜离子反应生成的氧化亚铜51（2）邻甲苯胺法利用某些芳香伯胺可与醛糖在热醋酸中生成有色化合物的原理。首先，邻甲苯胺试剂与醛糖的醛基缩合形成糖基胺和其Shiff碱的平衡混合物；然后经分子重排等反应生成蓝绿色化合物。在λ=630nm处有一吸收峰，吸光度大小与葡萄糖浓度成正比。（3）3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）糖类的测定在工业发酵以及微生物培养中具有特别的重要意义。如原料中淀粉含量是原料的重要质量指标；发酵过程中糖量变化可以衡量发酵正常与否；味精生产中终了也需通过发酵液中残糖的测定确定的。另外，淀粉酶、糖化酶的活力测定也是通过测定糖量来计算的。三、应用（2）邻甲苯胺法利用某些芳香伯胺可与醛糖在热醋酸中52

※谷氨酸发酵液中还原糖的测定在谷氨酸发酵中有着重要的指导意义。还原糖的变化与发酵正常与否、染菌与否关系密切。同时，发酵完毕和放罐时间也是通过残糖测定来确定的。一般情况下，染菌后，还原糖几乎不被减少；而正常发酵中，当还原糖小于1%时就可认为发酵完毕放罐。※谷氨酸发酵液中还原糖的测定在谷氨酸发酵中有着重要的53第二节蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质是由二十种氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，而测定蛋白质一般是利用蛋白质的结构或性质进行的1、蛋白质的肽链结构。如双缩脲反应2、酪氨酸和色氨酸对Folin-ciocalteu(酚）试剂反应或紫外吸收。如紫外分光光度法测定法。3、与色素结合的能力。如考马斯亮蓝染色法。4、沉淀后借浊度或光折射测定。一、凯氏定氮法测定蛋白质的含量（总蛋白测定）1、依据：蛋白质是含氮化合物且含氮量几乎是恒定的，平均为16%，故只要测出蛋白质的含量，再乘以6.25即为蛋白质的含量。第二节蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质是由二十种542、原理：用高温、浓硫酸将蛋白质消化，使其所含的氮素全部转化为铵盐，在加碱使碱盐成为氨经蒸馏分离出来，最后用酸滴定测定氮量。按每克氮相当于6.25克蛋白质计算蛋白质的量。消化炉++消化管漏斗蛋白质RCH(NH2)COOHCO2、NH3、SO2、H2O浓硫酸浓硫酸200℃200℃NH3+H2SO4（过量）

(NH4)2SO4(NH4)2SO4+NaOHNa2SO4+2NH3+H2ONH3+H3BO3(NH4)3BO3(NH4)3BO3+HClH3BO3+NH4ClHCl+NaOHNaCl+H2O2、原理：用高温、浓硫酸将蛋白质消化，使其所含的氮素全部转化55★在消化过程中添加的各种试剂的作用（1）浓硫酸：脱水使有机物炭化、氧化，浓硫酸在200度以上能使有机物破坏生成二氧化碳和水。（2）硫酸铜：作为消化的催化剂以促进化学反应的进行。（3）硫酸钾或硫酸钠等：用于提高消化时的沸点，可使沸点提高到400℃。（4）浓碱：可使消化液中的(NH4)2SO4分解游离出氨。★样品的预处理（1）固体样品中含氮量是用100克该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。定氮前应先将固体样品中的水分除去，一般样品的烘干温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。（2）若为液体样品，可直接量取一定体积的样品进行测定。★在消化过程中添加的各种试剂的作用（1）浓硫酸：脱水使有机物56二、双缩脲试剂法测定蛋白质的含量。蛋白质中的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与铜离子作用产生紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合生成的双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）在碱性条件下与铜离子作用形成紫红色的反应相似故称为双缩脲反应。这种颜色反应强度在一定浓度范围内与蛋白质含量成正比关系，经与同样处理的蛋白质标准溶液比较，即可求得蛋白质含量，此用于蛋白质的定量测定。定性测定：双缩脲反应至少含有两个-CO-NH-基团才能和铜离子络合，故氨基酸及二肽无此反应，三肽以上才能进行反应。可以通过此反应检查蛋白质的水解程度。但含有两个-CSNH-、-C（NH）NH-或CH2NH-等基团的化合物对双缩脲试剂反应亦呈阳性，所以本反应并非蛋白质所特有。二、双缩脲试剂法测定蛋白质的含量。蛋白质中的肽键（-57三、Folin-ciocalteu(酚）试剂法测定蛋白质含量此法Folin最早用于酪氨酸和色氨酸的测定，后由我国吴宪用于蛋白质定量测定，经多次改良成广泛应用的Lowry法，是对双缩脲的发展。蛋白质先与碱性硫酸铜（含酒石酸钾钠）作用。其肽键或烯醇化的肽键可与铜离子络合，络合物释放出电子，使后加入的酚试剂（主要成分为磷钨酸和磷钼酸）还原。

另一方面，蛋白质中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸也能使钨酸、钼酸或两者同时失去氧原子，还原成多种有蓝色的混合酸。最大的吸收峰在λ=745~750nm。一般可在650nm处比色测定。-N-C-HO=-N=COH-N-C-=O与Cu2+络合后释放出电子磷钨酸、磷钼酸蓝色混合酸此法的灵敏度为10~60μg/ml三、Folin-ciocalteu(酚）试剂法测定蛋白质含58此外蛋白质的测定方法还有：（1）紫外分光光度法许多蛋白质由于含有色氨酸和酪氨酸，在λ=280nm处有一吸收峰，可用于测定蛋白质的含量。但生物样品常混有核酸，而核酸的最大吸收峰λ=260nm处，在λ=280nm处也有较强的光吸收峰，可采用两个波长测定吸光度校正。用各种蛋白质和核酸不同比例的混合样品求得的各种经验公式，可以算出蛋白质浓度1）Lowry-kalacker公式蛋白质浓度（mg/ml)=1.45A280-0.74A2602)Warburg-christian公式蛋白质浓度（mg/ml)=1.55A280-0.76A260本法测定的蛋白质未加任何试剂和处理，可保留样品的生物活性，且可回收全部蛋白质，故常用于较纯的酶和免疫球蛋白等蛋白质含量的测定。此外蛋白质的测定方法还有：（1）紫外分光光度法许多蛋白59（2）染料结合法

在酸性条件下，蛋白质分子解离出带正电荷的-NH3+基团，它可与染料的阴离子产生颜色反应。借以同样处理的标准溶液对比，求出样品中蛋白质的含量。最常用的染料为考马斯亮蓝G-250，在酸性条件下，与蛋白质结合后由棕红色变为蓝色，最大吸收峰从465nm移至595nm，在150mg/dl范围内蛋白质浓度和吸光度成线性关系。（3）比浊法某些强酸如三氯乙酸、磺基水扬酸或两者混合等，能与生物碱结合而沉淀故称为生物碱试剂，它们能与蛋白质结合产生沉淀。这是蛋白质的共性，即在pH小于蛋白质等电点的溶液中，蛋白质分子带正电荷，可与带负电荷的三氯乙酸或磺基水扬酸结合形成沉淀。然后测定悬浮液的混浊度，与同样处理的已知含量的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量（2）染料结合法在酸性条件下，蛋白质分子解离出带正60四、蛋白质N-末端氨基酸DNS测定法即丹磺酰化测定法（二甲氨基萘磺酰氯法）（DNS-Cl）1、原理DNS-Cl是一种荧光试剂，能与蛋白质（或多肽）的N-末端氨基酸反应生成DNS-多肽，DNS-基团与N-末端氨基酸反应结合牢固，水解可得DNS-氨基酸和各种氨基酸。用醋酸乙酯抽提，然后进行层析法鉴定，层析图谱在360nm或280nm出产生强烈的荧光，与标准样品对照测知蛋白质或多肽的N-末端氨基酸，从而确定蛋白质多肽链的数目。2、反应过程DNS-Cl+蛋白质（多肽）DNS-蛋白质（多肽）DNS-氨基酸+各种氨基酸醋酸乙酯抽提碱性条件PH9.1（H+）酸性水解H2O四、蛋白质N-末端氨基酸DNS测定法即丹磺酰化测定法（二甲氨61五、蛋白质氨基酸排列顺序的测定-Edman法又称PITC法（异硫氰酸苯酯分析法）1、原理蛋白质或多肽的N-末端氨基酸能与PITC作用，生成苯氨基硫甲酰蛋白质或多肽，简称PTC-蛋白质或多肽，它们在酸性有机溶剂中加热时，N末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）并从肽链上水解下来，少一个N-末端氨基酸的多肽链保持完整，因为PITC的引入只使N-末端第一个肽键稳定性降低。PTC-氨基酸经有机溶剂抽提，进行层析鉴定并与标准样品对照从而测定出样品中N-末端氨基酸种类。剩余的多肽可再与PITC重复上述反应，逐步递减N-末端氨基酸，确定其顺序，称为Edman顺序降解法。五、蛋白质氨基酸排列顺序的测定-Edman法又称PITC法（622、反应过程PITC+蛋白质（多肽）PTC-蛋白质（多肽）PTH-氨基酸+少一个氨基酸的剩余多肽PH8.7~9.040-50℃H+H2O☆蛋白质多肽链氨基酸顺序测定的步骤（3）通过N-末端氨基酸的测定，确定蛋白质多肽链的数目（1）蛋白质进行提取、纯化。（2）断裂多肽链的二硫键并进行拆分多肽链。（4）利用Edman法测定各肽链氨基酸的排列顺序。☆几种水解断裂多肽链酶的介绍（1）胰蛋白酶：专一水解赖氨酸和精氨酸的羧基参与形成的肽键（2）糜蛋白酶：断裂苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键（3）胃蛋白酶断裂Leu、Phe、Trp和Tys等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键另、CNBr只断裂甲硫氨酸羧基参与形成的肽键。2、反应过程PITC+蛋白质（多肽）63六、蛋白质N-末端氨基酸FDNB测定法1、原理蛋白质或多肽的游离末端-NH2与DNFB（2，4-二硝基氟苯又称Sanger试剂）反应，生成DNP-蛋白质（多肽），由于DNFB与氨基形成的键对酸水解稳定性比肽键高，因此当DNP-蛋白质（多肽）经酸水解时，只有N-末端氨基酸为黄色的DNP-氨基酸衍生物，其余为游离的氨基酸，只要鉴别DNP-氨基酸即可得知N-末端的氨基酸。由于DNFB的衍生物DNP-氨基酸都呈黄色，有利与检测但它们对光敏感，因此应避光进行实验。2、注意六、蛋白质N-末端氨基酸FDNB测定法1、原理蛋白质64七、茚三酮显色法测定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α-氨基酸以及一切蛋白质都能与以上同反应生成蓝紫色物质茚三酮反应分为两步进行：首先，氨基酸氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被氧化成还原型的茚三酮；其次，还原型的茚三酮铜另一水合茚三酮分子和氨缩合成有色物质。β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应，因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮颜色反应，但能与茚三酮反应呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸，在定性定量测定试验中应严防干扰物的存在。七、茚三酮显色法测定氨基酸含量原理：除脯氨酸、羟脯65八、本身没有颜色的物质，通过适当的试剂反应，转化为有颜色的物质，如双缩脲反应、茚三酮反应和荧光反应等。如：荧光检测技术可分为原子荧光检测技术和分子荧光检测技术荧光检测的方法有三类：1）直接用荧光性物进行检测；2）利用非荧光物与荧光试剂进行反应，成为荧光性物质，再进行检测；3）在荧光性物质中加入消光物质，测定荧光的减少量。（一）邻苯二甲醛荧光法测定氨基酸邻苯二甲醛（OPT）作为一种荧光试剂，主要用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测方法。八、本身没有颜色的物质，通过适当的试剂反应，转化为有颜色的物66OPT+氨基酸、多肽和蛋白质荧光性化合物碱性还原剂激发波长为λ=340nm,荧光波长λ=455nm优点：OPT与氨基酸、多肽等反应不需加热、作用迅速、荧光试剂与氨基酸混合后5min便可测定荧光，灵敏度高荧光产物有一定稳定性。。（二）荧光胺荧光分析法测定肽的含量以荧光胺为荧光试剂，用于蛋白质、肽、氨基酸等的检测方法。其中合成类似的荧光试剂MDPE（2-甲氧基-2，4-二苯基-3-呋喃酮）。荧光胺或MDPE+含有伯胺基的化合物（氨基酸、多肽、蛋白质等）生成强荧光性化合物PH=8-9其激发波长为λ=390nm,荧光波长λ=475nmOPT+氨基酸、多肽和蛋白质67九、甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质在水溶液中存在如下平衡：不能用一般的酸碱指示剂氨基酸在高PH的水溶液中能发生下面的解离反应：R-CH-COO-R-CH-COO-+H2O-NH3+-NH2OH-九、甲醛滴定法测定氨基酸氨基酸是两性电解质在水溶液中存在如下68-NH3+是一个弱酸，使其完全解离时PH为11-13，若用碱滴定-NH3+所释放的H+来测定氨基酸，一般指示剂变色范围小于10，很难准确指示终点。常温下，甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合，生成羟甲基化合物R-CH-COO-R-CH-COO-+H+

-NH3+-NH2NaOH中和HCHO中性条件R-CH-COO-NHCH2OHR-CH-COO-N（CH2OH）2HCHO中性条件利用化学平衡原理，由于醛基的加入，使平衡右移，促使-NH3+释放H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色范围内（PH9.0）左右。此时可用酚酞作为指示剂，用标准NaOH溶液滴定。-NH3+是一个弱酸，使其完全解离时PH为11-1369

第三节蛋白质的免疫化学检测定义：利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析的技术。一、基本概念与原理1、抗体：将外源物质（不同种属的蛋白质或微生物）不经口（避开消化道）进入动物体内后，经过一定时间，动物的血清中出现与引入蛋白质起反应的物质（球蛋白）。2、抗原：能引起抗体产生的物质3、免疫反应：抗原与抗体起结合反应，形成沉淀的过程。二、蛋白质的免疫化学检测方法主要有凝集反应和沉淀反应（一）凝集反应1、定义：细胞性抗原（细菌、病毒、红血球等）与相应的抗体（抗血清）相混合时，细胞性抗原出现凝集成团，这叫做凝集反应。2、用途测定抗体（抗血清）的效价，也可用于细菌、病毒的分类。第三节蛋白质的免疫化学检测定义70（二）沉淀反应1、定义：可溶性抗原（蛋白质）与相应的抗体混合，当两者的比例适当，并有适当的盐类存在时，即可形成沉淀。这叫沉淀反应。2、注意条件1）选择适当的抗原、抗体比例9ml9ml9ml9ml9ml取1ml取1ml取1ml取1ml原液稀释10-1倍稀释10-2倍稀释10-3倍稀释10-4倍如果是药品则以稀释倍数的倒数为该药品的效价。假如青霉素在10-4稀释倍数时能全部杀死某种病毒，则此时青霉素对这种病毒的效价为10000个单位。（二）沉淀反应1、定义：可溶性抗原（蛋白质）与相应的抗体混合712）沉淀温度：一般为37℃或室温（25℃）3）沉淀PH：一般为中性偏碱（PH6.5~8.6)4)离子强度：一般为生物的生理盐水浓度0.9%NaCl溶液3、作用：可对抗原和抗体进行定性、定量测定。4、方法1）沉淀试验利用抗体+抗原沉淀为阳性反应2）界面试验抗体抗原（不同浓度）沉淀界面注：在实验中应利用生理盐水作空白对照实验。2）沉淀温度：一般为37℃或室温（25℃）3）沉淀PH：一般723）免疫扩散利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗原与抗体在浓度比例合适的部位产生沉淀带或沉淀环，从而检测蛋白质。★单向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中。当抗原适当过量时，便可形成沉淀带。抗体血清半固体基质扩散作用抗原沉淀带3）免疫扩散利用蛋白质在半固体基质上的扩散作用，使抗73★双向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中。当抗原适当过量时，便可形成沉淀带。抗体抗原扩散作用沉淀带抗血清不同蛋白质溶液★双向扩散：把可溶性抗原扩散到均匀分布于半固体基质中的抗体中744）免疫电泳123456123456代表不同的抗血清扩散电泳技术与免疫扩散相结合。4）免疫电泳123755）免疫亲和层析抗原和相应的抗体具有特异亲和力的生物分子对。6）免疫荧光检测技术第四节核酸的化学检测核酸磷酸+戊糖+碱基，针对核酸不同组成，可采取定磷法、二苯胺法和地衣酚法对它们进行化学检测。水解一、定磷法测定核酸含量可用于分析生物材料或制品中核酸、核苷酸所含的磷成分。

其过程为：先将核酸或核苷酸用强酸消化（如浓硫酸或过氯酸），使有机磷转化成无机磷；再用一般测定无机磷的试剂显色，如用钼酸铵与无机磷反应而生成蓝色的磷钼酸；最后根据无机磷的含量推算核酸或核苷酸的含量。5）免疫亲和层析抗原和相应的抗体具有特异亲和力的生物分子对。76蓝色的磷钼酸最大吸收峰在650~660nm波长处，测定OD650，测定磷的含量。二、二苯胺法测定DNA含量（比色法）为测定脱氧核糖的常用方法含脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。在595nm处有最大吸收峰。因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮醛戊醛。它再与苯胺作用产生蓝色物质，在一定范围内与DNA的浓度成正比。由于DNA和RNA都含有磷，所以在测定时必须把两者分开，然后分别进行测定。DNA+少量浓H2SO4+二苯胺蓝色物质100℃蓝色的磷钼酸最大吸收峰在650~660nm波长处，测77三、地衣酚法测定RNA含量（比色法）测定核糖的常用方法是苔黑酚（即地衣酚：3.5-二羟甲苯法）当含有核糖的RNA与浓HCl及3.5-二羟甲苯法）在FeCl3存在的情况下反应，在沸水浴中加热10-20分钟后，有绿色物质产生，这是RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3.5-二羟甲苯作用产生绿色物质，在670nm处有最高吸收峰，在一定浓度与RNA成正比。RNA+浓HCl+3.5-二羟甲苯法）绿色复合物100℃FeCl3实际上在酸溶液中，DNA与RNA的嘌呤核苷键易水解断裂而产生具有戊糠醛基的水解产物，称为去嘌呤核酸，后者可在酸中进一步变成糠醛衍生物，再与特异的试剂呈现颜色反应。由此可测定生物材料或制品中核酸的含量。三、地衣酚法测定RNA含量（比色法）测定核糖的常用方法是苔黑78四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，对260nm的紫外吸收波有一个最大的吸收，根据此性质可进行定性和定量测定。方法是：在260nm处测定样品的吸收度，然后与标准曲线对比，即可求出样品的核酸含量。此法的优点是：不易受其他物质的干扰、灵敏度高、正确而迅速。

核酸测定时应注意：用测糖法和测磷酸法来测定生物样品中核酸或其水解产物的含量时，一般需去掉干扰物质，如磷蛋白、糖类、磷脂和辅酶等杂质。四、紫外分析法由于核酸分子中的嘌呤碱和嘧啶碱具有79第六章光学检测技术定义：利用物质所具有的各种光学性质，或被检测物与其他物质进行颜色反应后，进行光学检测，对物质进行定性和定量及结构分析的技术。第一节旋光检测技术1、定义：2、原理：手性分子具有旋光性。即分子中具有不对称碳原子的物质如糖类、多数氨基酸、羟基酸等，能够使偏振光的偏振面产生旋转作用即旋光作用。旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度，旋光度的大小和方向可用旋光仪测定。第六章光学检测技术80物质的旋光度主要决定于物质本身的结构，同时与溶液的浓度、溶剂、温度、样品管的长度和光的波长有关系。物质的旋光度α为α=[α]λt.L.C/100通常采用比旋光度[α]λt.来表示各种物质的旋光度[α]λt.=100a/LC如20℃时，利用旋光仪测定谷氨酸水溶液的旋光度，2dm的样品管，测得α=+10.6，求谷氨酸的浓度。物质的旋光度主要决定于物质本身的结构，同时与溶液的81第二节荧光检测技术荧光检测技术可分为原子荧光检测技术和分子荧光检测技术1、原理：分子荧光的发生是物质分子吸收辐射能，从基态（低能级）跃迁至某一电子激发态中（较高能级）的某一振动能级。处于受激发态较高的振动能级中的分子通过运动或与其他分子碰撞而将过多的能量转移给其他分子，很快回到第一激发态的最低振动能级，然后发生自发辐射跃迁到基态，发射出一定波长的辐射能量，此能量即为荧光。第二电子激发态S2第一电子激发态S1基态S0碰撞失去振动能荧光不同的物质放射的荧光光谱不同，荧光的强度与物质的浓度有关。第二节荧光检测技术822、荧光检测的方法有三类：1）直接用荧光性物进行检测；2）利用非荧光物与荧光试剂进行反应，成为荧光性物质，再进行检测；3）在荧光性物质中加入消光物质，测定荧光的减少量。一、邻苯二甲醛荧光法测定氨基酸邻苯二甲醛（OPT）作为一种荧光试剂，主要用于氨基酸、多肽和蛋白质的检测方法。OPT+氨基酸、多肽和蛋白质