蛋白质与氨基酸第三章

（二）根据组成和溶解度1．单纯蛋白质（simpleprotein）:也称简单蛋白质，完全由氨基酸组成的蛋白质。单纯蛋白质的分类（根据溶解度的不同）(1)清蛋白（albumin）：溶于水及稀盐、稀酸或稀碱溶液。如血清清蛋白。(2)球蛋白（globulin）：不溶于水而溶于稀盐溶液，如血清球蛋白。(3)谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇及中性盐溶液，但溶于稀酸、稀碱，如米谷蛋白。(4)谷醇溶蛋白（prolamine）：不溶于水，但溶于70%～80%乙醇，如玉米醇溶蛋白。第一页，共一百二十八页。(5)组蛋白（histone）：溶于水及稀酸溶液，分子中含Arg、Lys较多，呈（弱）碱性，如小牛胸腺组蛋白。(6)鱼精蛋白（protamine）：溶于水及稀酸溶液，分子中含碱性氨基酸特别多，呈（强）碱性，如鲑精蛋白。(7)硬蛋白（scleroprotein）：不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液。如胶原蛋白、角蛋白、丝心蛋白、弹性蛋白等。第二页，共一百二十八页。2．缀合蛋白质（conjugatedprotein）：也称结合蛋白质，由蛋白质和非蛋白质两部分组成。缀合蛋白质的分类（根据非蛋白质即辅基的不同）(1)糖蛋白（glycoprotein）：含糖类，如胶原蛋白。(2)脂蛋白（lipoprotein）：含脂类，如血浆脂蛋白。(3)核蛋白（nucleoprotein）：含核酸，如核糖体。(4)磷蛋白（phosphoprotein）：含磷酸，如酪蛋白。(5)金属蛋白（metalloprotein）：含金属，如铁蛋白含Fe。(6)血红素蛋白（hemoprotein）：辅基为血红素，如血红蛋白。(7)黄素蛋白（flavoprotein）：辅基为黄素（FAD或FMN），如琥珀酸脱氢酶（含FAD）。第三页，共一百二十八页。名称代表物质酶（enzyme）核糖核酸酶、胰蛋白酶、果糖磷酸激酶、乙醇脱氢酶、过氧化氢酶、苹果酸酶调节蛋白（regulatoryprotein）胰岛素、促生长素、促甲状腺素、乳糖阻抑物、核转录因子1（NF1）分解代谢物激活剂蛋白（CAP）转运蛋白（transport

protein）血红蛋白、血清清蛋白、葡糖转运蛋白储存蛋白（storageprotein）卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白、铁蛋白收缩和游动蛋白（contractileandmotileprotein）肌动蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、动力蛋白、驱动蛋白结构蛋白（structuralprotein）α—角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白、蛋白聚糖支架蛋白（scaffoldprotein）胰岛素受体底物—1（IRS—1）、A激酶锚定蛋白（AKAP）、信号传递转录激活剂（STAT）保护和防御蛋白（protectiveandexploitiveprotein）免疫球蛋白、凝血酶、血纤蛋白原、抗冻蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素、蓖麻毒蛋白异常蛋白（exoticprotein）应乐果甜蛋白、节肢弹性蛋白、胶质蛋白（三）根据生物学功能分类第四页，共一百二十八页。1.活性蛋白质（activeprotein）包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子，绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。2.非活性蛋白质（passiveprotein）对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括胶原蛋白、角蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。第五页，共一百二十八页。二、蛋白质功能的多样性①酶的作用②运载作用③储存营养素④收缩或运动作用。⑤结构材料。⑥防御功能。⑦调节功能。⑧缓冲作用。第六页，共一百二十八页。三、蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次构型：是指具有相同结构式的立体异构体中取代基团在空间的相对取向，不同的构型如果没有共价键的破裂是不能互变的。构象：是指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态，构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。第七页，共一百二十八页。为了对蛋白质结构叙述的方便，人为地将蛋白质的结构分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。蛋白质的一级结构又称初级结构，二级结构、三级结构、四级结构的三度空间排列称蛋白质的空间结构、高级结构、三维结构或构象。第八页，共一百二十八页。随着蛋白质化学研究的进展，越来越多的人认为在二级结构和三级结构之间应加入超二级结构和结构域这两个层次，所以蛋白质的结构层次为：一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构第九页，共一百二十八页。组织层次：一级结构：多肽链的氨基酸序列。二级结构：指多肽链借助氢键排列成自己特有的α－螺旋和β－折叠股片段。三级结构：是指多肽链借助各种非共价键（或非共价力）弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。四级结构：是指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。第十页，共一百二十八页。四、蛋白质的化学组成有些蛋白质是生物体的结构物质，有些蛋白质是生物体的功能物质。

近年来的研究还指出蛋白质在遗传信息的控制，细胞膜的通透性以及高等动物的记忆等方面起了重要作用。总而言之，一切重要的生理活动都离不开蛋白质，蛋白质是生命现象的最基本的物质基础。第十一页，共一百二十八页。化学组成元素组成：所有蛋白质都含有C、H、O、N四种元素，大多数蛋白质还含有少量的S，有些蛋白质还含有一些其它元素，如P、Fe、Cu、Mo、I等。各种蛋白质的含氮量都很接近，都在16%左右，因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质。第十二页，共一百二十八页。蛋白质水解：用H+，OH-或酶将蛋白质彻底水解，可以得到许多种氨基酸的混合物，说明氨基酸是蛋白质的基本结构单位。第十三页，共一百二十八页。酸水解：H2SO4或HCl进行水解。不引起消旋作用，得到L－氨基酸。色氨酸完全被破坏，羟基氨基酸有一小部分被分解，酰胺基被水解。碱水解：NaOH水解。多数氨基酸被不同程度的破坏，产生消旋。精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。色氨酸在碱性条件下稳定。酶水解：不产生消旋，也不破坏氨基酸。但往往水解不彻底，部分水解。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、以及胃蛋白酶。第十四页，共一百二十八页。第二节蛋白质的基本结构单位——氨基酸（aminoacid,aa或AA）

一、氨基酸的通式、分类、结构和代号1、氨基酸的通式或第十五页，共一百二十八页。2、氨基酸的分类、结构、代号氨基酸有两种分类方法(1)按侧链R基的结构第十六页，共一百二十八页。(2)按侧链R基的极性第十七页，共一百二十八页。中性氨基酸氨基酸的结构、代号:第十八页，共一百二十八页。第十九页，共一百二十八页。第二十页，共一百二十八页。第二十一页，共一百二十八页。第二十二页，共一百二十八页。第二十三页，共一百二十八页。第二十四页，共一百二十八页。二、氨基酸的构型、旋光性和光吸收构型：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三维空间上就有两种不同的排列方式，它们互为镜影，这两种不同的构型分别称为D-型和L-型。第二十五页，共一百二十八页。以丙氨酸为例：第二十六页，共一百二十八页。如含两个手性碳原子，则有４种立体异构体，分别称为Ｄ-,Ｌ-，Ｄ别-和Ｌ别-氨基酸。L-苏氨酸(L-threonine)D-苏氨酸(D-threonine)L-别-苏氨酸(L-allo-threonine)D-别-苏氨酸(D-allo-threonine)蛋白质中的氨基酸都是L-型。(Gly除外)第二十七页，共一百二十八页。旋光性：组成蛋白质的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋转，向左旋转的称左旋，用“一”号表示，向右旋转的称右旋，用“＋”号表示。消旋外消旋内消旋第二十八页，共一百二十八页。第二十九页，共一百二十八页。光吸收：组成蛋白质的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe对紫外光有一定的吸收，这是因为它们分子中含有苯环，是苯环的共轭双键造成的，这三个氨基酸的光吸收都在280nm附近。Trp:λMAX在280nm处Tyr：λMAX在275nm处Phe：λMAX在257nm处第三十页，共一百二十八页。第三十一页，共一百二十八页。三、氨基酸的酸碱性质和等电点1、氨基酸的两性离子形式两性离子(dipolarion)第三十二页，共一百二十八页。2、氨基酸的两性解离和等电点BrÖnsted的酸碱理论，即广义酸碱理论。HAA-+H+酸碱质子第三十三页，共一百二十八页。氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。Asanacid（protondonor）：Asabase（protonacceptor）：第三十四页，共一百二十八页。不同pH时氨基酸以不同的离子化形式存在：正离子两性离子负离子氨基酸所带净电荷为“零”时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（isoelectricpoint），以pI表示。二元酸一元酸碱第三十五页，共一百二十八页。实验证明在等电点时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。当溶液的pH=pI时，氨基酸主要从两性离子形式存在。pH<pI时，氨基酸主要以正离子形式存在。pH>pI时，氨基酸主要以负离子形式存在。第三十六页，共一百二十八页。3．氨基酸的酸碱滴定曲线Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[质子受体][质子供体]酸碱滴定曲线第三十七页，共一百二十八页。第三十八页，共一百二十八页。第三十九页，共一百二十八页。4．等电点的计算中性氨基酸：以Gly为例K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI时，[Gly+]=[Gly-][Gly±][H+]K1=[Gly±]K2[H+][H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly第四十页，共一百二十八页。酸性氨基酸，以Asp为例：第四十一页，共一百二十八页。碱性氨基酸，以Lys为例：第四十二页，共一百二十八页。氨基酸的甲醛滴定第四十三页，共一百二十八页。第四十四页，共一百二十八页。四、氨基酸的化学性质第四十五页，共一百二十八页。（1）与HNO2的反应1．α-氨基参加的反应第四十六页，共一百二十八页。（2）酰基化反应酰氯：苄氧酰氯（Cbz-Cl）:对甲苯磺酰氯(Tos-Cl):叔丁氧酰氯(Boc-Cl):酸酐：邻苯二甲酸酐：（R’＝酰基）第四十七页，共一百二十八页。Cbz-ClCbz-氨基酸第四十八页，共一百二十八页。氨基酸与5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansylchloride,DNS）的反应酰化试剂与氨基酸反应生成酰胺后，封闭了α-氨基，使α-氨基不再参与其他反应，因此这些试剂在多肽和蛋白质合成中常用为氨基的保护剂。第四十九页，共一百二十八页。（3）烃基化反应（测N-末端氨基酸）①与2、4一二硝基氟苯的反应（Sanger反应）2，4一二硝基氟苯（R’＝烃基）第五十页，共一百二十八页。DNFBDNP-氨基酸（黄色）第五十一页，共一百二十八页。②与苯异硫氰酸（酯）的反应（Edman反应）PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸第五十二页，共一百二十八页。2．α-羧基参加的反应（1）成盐和成酯反应第五十三页，共一百二十八页。酰化氨基酸对硝基苯酚酰化氨基酸对-硝基苯酯（活化酯）（式中Y＝酰基）第五十四页，共一百二十八页。（2）成酰氯反应使氨基酸的羧基活化，易与另一氨基酸的氨基结合，在多肽人工合成中用于活化羧基。第五十五页，共一百二十八页。（3）成酰胺反应体外：体内：Asp+NH4ATP酶Asn+第五十六页，共一百二十八页。（4）脱羧基反应第五十七页，共一百二十八页。（5）叠氮反应第五十八页，共一百二十八页。3.α-氨基和α-羧基共同参加的反应（1）茚三酮反应注意几点：第五十九页，共一百二十八页。（2）成肽键第六十页，共一百二十八页。4．侧链R基参加的反应（1）-S-S-和-SH的氧化还原反应R-SH：HS-CH2CH2OH巯基乙醇（mercaptoethanol）HS-CH2COOH巯基乙酸（mercaptoaceticacid）HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）第六十一页，共一百二十八页。半胱氨酸的-SH很活泼，很容易在空气中重新氧化形成二硫键，一般可用卤代化物对-SH进行保护。

第六十二页，共一百二十八页。（2）苯环的黄色反应phe+少量浓H2SO4+浓HNO3黄色TyrorTrp+浓HNO3黄色第六十三页，共一百二十八页。（3）酚基的Millon反应（米伦氏反应）HgNO3

Tyr+ Hg(NO3)2 白色沉淀后变红，鉴定酚基HNO3

第六十四页，共一百二十八页。（4）pauly反应His+重氮苯磺酸红色（棕红色）Tyr+重氮苯磺酸橘黄色第六十五页，共一百二十八页。（5）Folin一酚反应+磷钼酸Tyr磷钨酸orPhe蓝色（钼蓝与钨蓝混合物）第六十六页，共一百二十八页。氨基酸化学性质总结（重点）1.亚硝酸反应2.酰化反应：（苄氧酰氯、丹磺酰氯－二甲基氨基萘磺酰氯反应（DNS—Cl））3.烃基化反应2，4—二硝基氟苯反应（DNFB）、苯异硫氰酸酯(PITC)4.甲醛反应5.α-羧基的成盐成酯反应6.茚三酮反应7.二硫键的氧化还原反应第六十七页，共一百二十八页。五、氨基酸分析1．分配层析法：分配系数Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的，第六十八页，共一百二十八页。（1）逆流分溶（逆流分配）第六十九页，共一百二十八页。第七十页，共一百二十八页。（2）纸层析

单向纸层析图Rf值

第七十一页，共一百二十八页。双向纸层析图第七十二页，共一百二十八页。（3）薄层层析第七十三页，共一百二十八页。2．离子交换层析法原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。第七十四页，共一百二十八页。离子交换树脂：化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的高分子聚合物。外观：第七十五页，共一百二十八页。阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基-SO3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基-N+(CH3)3OH-

第七十六页，共一百二十八页。第七十七页，共一百二十八页。X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱第七十八页，共一百二十八页。第七十九页，共一百二十八页。第三节肽（peptide）一、肽的结构和命名肽是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键连接而形成的化合物。Peptidebond第八十页，共一百二十八页。氨基酸之间通过肽键连接形成的链称肽链。N端氨基酸残基氨基酸残基C端肽链书写方式：N端→C端肽链有链状、环状和分支状。第八十一页，共一百二十八页。命名：根据氨基酸组成，由N端→C端命名丙氨酰甘氨酰亮氨酸Ala－Gly－Leu(orAla•Gly•Leu)第八十二页，共一百二十八页。第八十三页，共一百二十八页。第八十四页，共一百二十八页。第八十五页，共一百二十八页。第八十六页，共一百二十八页。共振结果：限制绕肽键的自由旋转酰胺平面（肽平面）C-N具有40％的双键性质，绕键能障高肽键具有永久偶极性质反式构型第八十七页，共一百二十八页。二、肽的理化性质1．两性解离与等电点

肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。

由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK变化不大。第八十八页，共一百二十八页。肽的等电点：肽所带净电荷为“零”时，溶液的pH值。例：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0ε-NH+3pK10.6。计算Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。pI=(8.0＋10.6)/2=9.3第八十九页，共一百二十八页。2．肽的化学性质肽的化学性质与氨基酸相似，如两性解离、等电点等，但肽有与氨基酸不同的特殊反应（1）双缩脲反应（2）肽键的紫外吸收 210～230nm双缩脲＋碱性CuSO4溶液紫色两个或两个以上的肽键化合物能发生双缩脲反应生成紫色复合物第九十页，共一百二十八页。三、天然存在的某些活性肽1．肌肽和鹅肌肽肌肽（carnosine）:β-Ala-His鹅肌肽（anserine）：β-Ala-1-Me-His第九十一页，共一百二十八页。2．谷胱甘肽(glutathione,GSH)第九十二页，共一百二十八页。3．多肽抗菌素第九十三页，共一百二十八页。4．多肽激素第九十四页，共一百二十八页。5．神经肽 甲硫氨酸脑啡肽 Tyr–Gly–Gly–phe-Met亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu功能：镇痛如脑啡肽(enkephalin)α－鹅膏蕈碱第九十五页，共一百二十八页。第四节蛋白质一级结构及一级结构分析当多肽的分子量大到足够具有一定的空间结构时就称为蛋白质。蛋白质与多肽的主要差别：分子量，空间结构第九十六页，共一百二十八页。（一）蛋白质的一级结构（primarystructure）1．定义：蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序（sequence），一级结构的主要连接键是肽键。第九十七页，共一百二十八页。2．蛋白质一级结构的测定概况:序列测定前的准备工作：样品的纯度相对分子质量肽链的数目氨基酸组成一级结构的测定主要用小片段重叠的原理第九十八页，共一百二十八页。蛋白质测序的策略：测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子的多肽链断开多肽链内的二硫桥分析每以条多肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N—末端和C—末端残基裂解多肽链成较小的片段测定各肽段的氨基酸序列重建完整多肽链的一级结构确定半胱氨酸残基间形成的S—S交联桥的位置第九十九页，共一百二十八页。序列测定方法（1）末端分析：包括N端分析，C端分析N端分析方法①二硝基氟苯法（DNP法、DNFB法或FDNB法）第一百页，共一百二十八页。②丹磺酰氯法（DNS法）第一百零一页，共一百二十八页。③苯异硫氰酸(酯)法（PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法）第一百零二页，共一百二十八页。④氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法AlaValGly第一百零三页，共一百二十八页。亮氨酸氨肽酶（Leucineaminopeptidase,LAP）专一性:A=非极性氨基酸时快A=其它氨基酸时慢ABN端A=Leu时最快第一百零四页，共一百二十八页。N端氨基封闭的几种情况：乙酰化、焦谷氨酰环化、环状肽等。第一百零五页，共一百二十八页。C端分析①硼氢化锂还原法第一百零六页，共一百二十八页。②肼解法：也称联氨法苯甲醛的作用第一百零七页，共一百二十八页。③羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法第一百零八页，共一百二十八页。4种羧肽酶的来源和专一性羧肽酶来源专一性CpA胰脏能释放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰脏主要水解C端为Arg或Lys的肽键CpC植物或微生物相当广泛，几乎能释放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可释放C端所有氨基酸第一百零九页，共一百二十八页。（2）肽链的拆开和分离共价键非共价键第一百一十页，共一百二十八页。第一百一十一页，共一百二十八页。（3）氨基酸组成的分析完全水解：酸水解碱水解第一百一十二页，共一百二十八页。（4）肽链的部分水解化学方法：溴化氰（CNBr）裂解法:第一百一十三页，共一百二十八页。羟胺裂解法：专一性地水解Asn－Gly之间的肽键，但专一性不强，Asn－Leu，Asn－Ala也能部分裂解。第一百一十四页，共一百二十八页。酶解方法第一百一十五页，共一百二十八页。（5）肽段的分离和氨基酸序列测定分离：层析，凝胶电泳，HPLC,凝胶过滤等序列测定：Ed