2013第3章污染物生物效应检测

第三章污染物的生物效第一 生物测试及方第二 一般毒性试第三 生物的分子和细胞水平检第四 生物致突变、致畸 效应检第五 微宇宙一、生物测试生物测试（Bioassa）指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境、者只能测定污染物的浓度。如通过水污染的生物测试可获得以下数据：1.各种环境因素水污染的生物测试：毒性试验（Toxicity大气污染的生物测试：植物人工熏气（ArtificialFumigationfor应应1生物测试的分短短短期中期长期根据生物测试时间 于高浓度污染物下进行。指标为LC50,IC50,EC50。多为静止式，中期测试：介于短期和长期之间，一般8-90d算做中期。（静止和流动式2、受试生物的选择——有代表性、对毒物具有敏感性、试验的可D 3、生物测试的标准 受众多因素影响，为便于比较和分析，故必须把测试物试验鱼种应是斑马担尼鱼(真骨鱼总目，鲤科）试验鱼体长30±5mm，体重0.3±0.1g新配制的标准稀释水pH为7.8±0.2，硬度为250mg／L左右(以CaCO3蒸馏水或去离子水由下面4种溶 A毒物（Toxicant）：能引起生物体功能或器质性损产生暂时或永久性的P99，以引 的剂量大小来区别“毒物”与“非毒物”，根本因素——毒剂(一)按毒物的用途及分布范围分工业化学品：如生产原料、辅料、等；农用化学品：如化肥、杀虫剂等医用化学品：如药物、消杀剂等环境污染物：如废水、废生物毒素：如动物毒素、植物毒素军事毒物：如芥子气 毒素放射性物质：如放射性核素、天然放射性元素(二)按化学结构和理化性质分芳香卤代碳氢化学(三)按毒性级别分可分为剧毒、高毒、低毒(四)按毒作用的生理生化机制分

气液粉尘可分为巯基抑制剂、高铁蛋白形成剂….(五)按毒作用主要部可分为肝毒物、肾毒物、神经毒物…(六)按毒物生物学效可分 物、致畸物、致突变物B 毒性作用或毒效应（ToxicEffect）：无损害作用（Non-adverseEffect）：不引起机体形态、生长发育 迟发性迟发性毒作用(Delayedtoxiceffect)：是指机体接触化学物质症状失或虽 症状但似已恢复，经过一定时间间隔才表现出来的毒性作用如CO和有机。远期毒作用(Remotetoxiceffect)：指化学物作用于机体或停止接触后，经若干年，而后发生不同病理改变的毒作急性急性毒作用(Acutetoxiceffect)：指短时间内(24h)一次或多次接触化学物后)指化学物质引起受试所需要的最低剂量或浓最大耐受剂量或浓度altolerancedoseMTD,LD0MTC化学物质不引起受试对象出 的最高剂量或浓度(区分急性和慢性,指化学物质引起受试实验对象中的个别成员出的最高剂量或浓半数致死剂量/浓度(medianlethaldose,指化学物质引起一半所需要的最低剂量或浓D.效应（effect）:是量效应，表示接触一定剂量的环境污染物后，引起的机 剂量-效应关系（Dose-effectRelationship）：不同剂量 或者群体中表现来的量大小之间的关 剂量-反应关系（Dose-responseRelationship):不同剂量与质效应发生率之间的关是评价化学物质毒性与确定安全接触水平的基本即随着外源化学物的剂量增加，对机体的毒效应的程度增加，或出现某种效 线、直线或S-型曲线等多种形状。是化学物质安全评价的基本依据率率图3剂量－反应曲线（S形线型

率率率位率位图4剂量－反应曲线 性(Risk)：也称 性或风险度，是指在特定的接触条件下终生接触某境因素引 或群体产生有害效应(损伤、疾病 )的预期频率危害性(Hazard)：指定性表示外源化学物对人群健康安全性(Safety)：是指 度，可为社会接受( 度可忽略)，即笼地指在通常条件下接触化学物 和人群健康不会引起有害作用 最小有作用剂量(Minimaleffectivedose)或称阈剂量或阈浓度：是指在一定时间内，一 每日容许摄入量(acceptabledailyintake,ADI)：指允许正常成人摄入体内的特定化学物质而 不引起任何损害作用的剂量最高容许浓度 alallowableconcentration,MAC)：某一外源化学物可以在境中存在而不致 造成任何损害作用的最高浓度 EffectZone）：是一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外 急性毒作用带=半数致死剂量/急性毒性最小有作用剂量（急性阈值 种外来化合物引 慢性毒作用带=急性毒性最小有作用剂量/慢性毒性最小有作用剂=急性阈值/慢性阈比值越大，表明引起慢性毒 半数效应浓度（MedianEffectConcentration,EC50指能引起50％受试生物的某种效应（ 效应）变化的浓度。（效应化半数抑制浓度（MedianInhibitionConcentrationIC50指能引起50％受试生物的某种效应（ 效应）抑制的浓度。（效应制半数致死时间（MedianLethalTime,LT50指在特定温度和剂量下，受试生 一半所需要的时间半数效应时间（MedianEffectiveTime,ET50指在特定温度和剂量1、毒性的计量单我国工业毒物急性毒

高毒低毒

≤

≤外来化合物急性毒性分级

对人可能致死的估计 剧毒高毒3中低毒微毒 6、膜自由基损伤：①膜脂质过氧化损害。②蛋白质的氧化损害。③DNA的氧化损害 8、选择性细胞。这种毒性作用是相当特异的。(例如，高剂量锰可引起脑部基底神经节多巴胺能细胞损伤，产生的神经症状几乎与帕金森氏病难以区分。在发育的某一阶段给时婴儿缺肢畸形。)9、体细胞非致死性遗传改变。毒物和DNA的共价结合也可以通 表达的结果，受细胞内外因素的调节，如果这一调控 性主要是经口、经皮肤及经呼吸道吸入三种染毒途1、经口染②喂饲喂饲方法染毒是将化学物溶于无害的溶液中拌入饲料或饮用水中，使动物2、经呼吸道染3、经皮肤染 4、其它途径染急性毒性：是指实验动物一次接触或24小时内多次接触某一化学物所引起 ●评价化学物对机体的急性毒性的大小、毒效应的特征、剂量-反应（效应关系，并根据LD50值进行急性●为亚慢性、慢性毒性研究及其他毒理试验接触剂量的设计和观察指标的择提供依●为毒作用机制研究提供线哺乳动物急性毒性 2.水生生物急性毒性试性 鱼类急性毒性试 水蚤类（枝角类）急性毒性试 藻类急性毒性试验3.蚯蚓急性毒性试1、试验动 生物级别分类与选择2、实验动物的标记和随机分3、剂量选 4、动物染5、急性毒性反应的观察与记

一般用灌胃法和人工熏气受试物的配制：配制试验所需的最高剂浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度 6、统计学分析与半数致死剂量的计算（寇氏法、几率单位法数(Y)、动 百分比(P，以小数表示)以及统计公式中要求的其他计算数据项目 时间短，一般1-4天，不更换试验适用于：性质稳定、不易挥发、耗氧量少的物鱼类急性毒性试试验鱼选要求：有区域代表性，易于饲养，对毒物敏感 健常用的有：青、草、鲢、鳙鱼， 、鲤鱼、鲫剂量选择与染毒：先做预试验确定LD0和LD100，在LD0和LD100之间需要按等比级数插入5-7个浓度组，染毒48-96h。另加一空鱼类急性毒性判定的急性毒性反应的观察与记统计学分析与相关指标的计算【寇氏法、直线内插法、对数-概率模式法水蚤类（枝角类）急性毒性试 50%的毒物浓度来表（1）试验指（2）常用的藻类生长测试

叶绿素含 混合液萃取法、热乙醇检测环境化学物质对土壤 对动物的急 滤纸接触毒性试验和检测指标试验周期

（一）、亚慢性毒性试1、概念 物体在约1/30～1/20生命期间少量反复接触某种外来物质引起的损害作用的毒2、目的●进一步确定其毒作●研究亚慢性毒性●估计最小有作用剂量和最大无作用剂●为慢性试验的剂量设计及观察指标提供依3、受试物剂量：一般用LC50(LD50)的1/80～1/50作为亚慢性实验剂（二）慢性毒性试阈剂量和最大无作用剂量，为进行该化合物的性评价与制定人接触该化合物的安全45、剂量的选择与分受试动物要 以亚慢性阈剂量或其1/5~1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的以LD50的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50的1/100为预计慢性阈剂量，以LD506 7

蓄积毒性：是指低于一 产生原因：V进入﹥V消谢转化与排出的速度或总量时，化学物就有可能在机体内逐渐增加并贮留的现象蓄积作用是发生慢 的物质基一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种重要依物质蓄积——实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够测得机内存在该化学物或其功能蓄积可能由 体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积或者是由于每次机体接触化学物之后所引起的损害累积蓄积系数法 生物半减期法 20天蓄积试验A积系数应的总有效剂量LD50（n）

<1量

之比值，即使K＝

/

1 积毒性系数。当染毒剂量累计达到相当5倍LD50以上时，若受试动物中出现某种毒性效应或 每天0.15×LD50，第三期为每只每天0.225×LD50,依次类推……），直至该动物 B生物半减期转运和转化作用过程而被消除一半所需要的时间 生物半减期T1/2=（t2－t1）log2/（logy1－logC20天蓄积试验组总剂量分别为1，2，4，10LD50。观察停药7天后 如1/20LD50组有 如1/20LD50组 ，各剂量 也剂量-反应关系，可认为无明显蓄积毒性 一、加合物的测是化学物经生物转化后的亲电活性产物与DNA链特异位点上的共价结合DNA加合物出现在疾病发病之前,甚而出现在接 - 免疫法：抗原－抗体反应。1个加合物/107－108个核苷荧光法：某些DNA-加合物具有荧光特性，故而可被检测到。荧光法不破坏DNA链，并可区分加合物的不同立体异构体及DNA链上的不同位点上的加合32P-后标记法：目前最常用 法，灵敏度高过程：DNA－酶水解－分离（单核苷酸或加合物）－32PATP标记加合二、蛋白加合物的测最常见的为Hb（血红蛋白）-加合物因为Hb-加合物的生存期为120d左右，因而它可作为中长 的指标最常用的方法为（GC-MS法）和免疫法检测。（原理同DNA-加合物的测定法三、一般代谢酶的活性测定（底物的消耗或产物的增加 2、腺三磷酶（ATPase）。钼蓝法四、解毒系统酶类诱

1、混合功能氧化酶活性测定（直接法和间接法2、谷胱甘肽硫转移酶（GST,non-Se-GSH-Px）活性测定（间接法，测产物生成量五、抗氧化防御系统1、过氧化氢酶（Ct催化H2O2）：衰老的原

2、谷胱甘肽过氧化酶（GPx清除脂类过氧化物，有机氢过氧化物直接法：提纯GPx，GPx在255nm处呈最大吸收峰。此法灵敏度 突变分碱基对的改变； 体细胞突变的不●致其他不显性致死突显性存活突变（显性非致死性突变）：如抗维生素D佝偻隐性突变遗传：如血友癌变致畸衰老癌变致畸衰老死胎 突变(gene碱基置换(base—pair指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突转换颠换损点开始碱基序列完全改变，形成错误的，并转译成为不正3、致突变试（一）体 突变试（二）细胞遗传学试畸变试验微核试（三）体 突变试显性致死突变试果蝇伴性隐性致死试（四）DNA损伤试 （1）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(SaloellaTpiriumeere Asa)：利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株（突变型）测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型（i）回变到野生型（his+）的试验方法突变型（营养缺陷型 野生常用菌株：组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（突变型培养基上，多数不能存活。假致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变生型

株。(his

受试

培养基（不含组氨酸（2）

中国地 CHO细胞株（突变型小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株（突变型次黄嘌呤鸟嘌呤硫酸核糖基转移酶（HGPRT 利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用 的数目和态的改变情体内：骨髓细胞或其他组织（胸腺、脾 细胞等） 畸变微核的形成：微核的产生与 ，在细胞后期遗留在细胞质中， 有 毒物的作用使个 试验目的检测细胞：常用啮齿类动物骨髓多染红细胞（PCE）（三）体 突变试1显性致死突变试验（检测外来化合物对动物生殖细 2果蝇伴性隐性致死试验（致突变物可能在雄性果蝇配子 （四）DNA损伤试1姐妹染色单体交换试验（SisterChromatideExchangeTest 原理：5-Brdu（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷（T）的类似物，掺入DNA，经过二 2DNA3单细胞凝胶电泳（彗星试验电泳检测，根据“彗星”头部和尾部的大小和比例确定DNA损伤程度 2、畸胎3、致畸物（原4、致畸作用（Teraogenesis）——致畸物通 一般 12 （一）基本概1、化 作用和化 2、

1775年——英国 阴囊1895年——德国Rehn职业 1915年— 1922年——英国Kennway1945年——英国Case职业 3、肿瘤抑 （tumorsuppressor又称抗 ，或抑 （anti-oncogene）、隐性 oncogene）。在正常细胞中第四 1 的阶段学 过程有多