实验1大肠杆菌的分离和培养

选考第33题内容：选修1生物技术实践、选修3现代生物科技专题形式：一般10个填空（1分/空）

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2个（单项）选择（2分/题）生物选考试题分布：选择题：25+3（50+6=56分）非选择题：3+2（6+7+7+14+10=44分）选修1生物技术实践第一部分微生物的利用实验1大肠杆菌的培养和分离实验2分离以尿素为氮源的微生物第二部分酶的应用实验4果汁中的果胶和果胶酶实验6

α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测第三部分生物技术在食品加工中的应用实验8果酒及果醋的制作实验10泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定第四部分浅尝现代生物技术实验11植物的组织培养第一部分微生物的利用微生物：是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，如酵母菌、细菌、放线菌、霉菌、蓝细菌和病毒等。绝大多数微生物与传染病无关，90%以上的微生物是对人类有益的。微生物有多种用途，许多抗生素来源于放线菌和霉菌；有些食品由微生物发酵制成，如酒由酵母发酵产生，腐乳由红曲霉和毛霉发酵制成。实验1大肠杆菌的培养和分离基本要求1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的培养。一、大肠杆菌

革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌在肠道中一般对人无害但也有一些菌株对人体是有害的，可侵袭肠粘膜并产生毒素任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。结晶紫碘液95%乙醇革兰氏染色法1min革兰阳性

革兰阴性1min脱色蕃红复染菌落（colony）：一个细菌细胞在固体培养基上发展成一个肉眼可见，具一定形态结构的子细胞群。光滑型菌落粗糙型菌落二、细菌的培养和分离1、实验仪器设备：移液枪接种环玻璃刮刀超净工作台（保证无菌环境）高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱摇床2、培养基：平板斜面固体培养基LB培养基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL琼脂：1g液体培养基固体培养基调pH值菌膜菌沉淀均匀浑浊对照液体培养基（培养液）3、实验步骤：（1）培养基、培养皿灭菌

——高压蒸汽灭菌法

将配制好的50mlLB液体和固体培养基分别装入250ml三角瓶中，加上封口膜；

将培养皿用牛皮纸包好；置于灭菌锅内1kg压力灭菌15min

（121℃）无菌技术

最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脱脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各种金属、塑料、封口膜及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。（160℃2h或170℃1h）高压蒸汽灭菌法：玻璃器皿、金属、移液枪头等（火焰）灼烧：接种环、试管口、三角烧瓶口紫外灯+过滤风：超净台灭菌消毒：如75%酒精棉球（消毒：利用化学或物理方法，杀死大部分致病微生物的过程。）（2）倒平板

灭菌后，待灭菌锅压力与大气压力相同时打开锅盖将有培养基的三角瓶和培养皿放到超净台上打开超净台的紫外灯和过滤风，待固体培养基冷却到60℃时，关闭紫外灯用酒精棉球消毒桌面和手。倒平板：10-12ml培养基/培养皿

每倒入一个后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，并形成平面。酒精灯旁：左手？右手？制作试管斜面：

将配制好的呈熔化状态的培养基转移到试管中时必须用三角漏斗

灭菌试管冷却到50℃左右，把试管棉塞一端搁在玻棒上，待冷凝后即成试管斜面

将分装好的含培养基的试管灭菌P21小字部分1/3在试管外，2/3在试管内正确不正确棉塞制作（3）接种培养

左手：将大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角烧瓶，靠近酒精灯火焰；

右手：拿接种环，并用无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使环接触培养基，再取菌体；

将菌体放入三角瓶的液体培养基中，瓶口封口膜和管口棉塞复原；

将三角瓶置于37℃摇床振荡培养12h。（4）划线分离

在酒精灯火焰上灼烧接种环；

将摇床上培养了12h的菌液打开，接种环部分深入到菌液中；

在固体培养基的平板上连续划线，接种环只在菌液中蘸菌液一次，划线后盖好培养皿；

将培养皿倒置（盖在下面），放到恒温培养箱中培养12-24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。划线分离法划线的起点要有菌，且每一次新的起点应比前一次的起点菌含量（浓度）低划线的最终点不能与前面的划线点重叠除第1次外，其余几次划线前，都要将接种环火焰灼烧恒温培养箱平板倒置防