乙型肝炎病毒颗粒超离纯化

乙型肝炎病毒颗粒超离纯化第1页/共45页低速离心:6,000rpm以下第2页/共45页高速离心:25,000rpm以下第3页/共45页超速离心:30,000rpm以上第4页/共45页第5页/共45页第6页/共45页第7页/共45页1.离心力2.相对离心力(RCF)3.沉降速度4.沉降系数(S)5.沉降时间和沉清因子(K)离心场中的基本物理概念第8页/共45页第9页/共45页离心力

F=ma=mω2r

ω:角速度(弧度rad/秒)ω=(2π×RPM)/60r:离心半径第10页/共45页相对离心力(RCF)

同一颗粒在离心时同地球的重力相比较后得到的值

RCF=离心力/重力=mω2r/mg=ω2r/g=1.12r(RPM/1000)2第11页/共45页第12页/共45页沉降速度V

在离心力场的作用下,单位时间内沉淀物运动的距离V=d2(ρp-ρm)ω2r18μ(f/f0)V大小与颗粒直径(d2)成正比V与颗粒密度同介质密度差(ρp-ρm)

成正比V与外加离心场(ω2r)成正比当颗粒密度等于介质密度时,沉降速度接近于零V与介质粘滞度μ成反比,粘滞度增加速度减慢V与颗粒形状有关.颗粒偏离球形越大f/f0的摩擦比也越大,速度越慢第13页/共45页沉降系数(S)Svedberg

定义:单位离心力作用下的沉降速度物理意义:被测颗粒达到极限速度时所需要的时间.单位为秒.1S单位=10-13seconds

沉降系数与物质的质量、形状、密度等因素有关,也受温度,水化密度,pH的影响,在实际工作中通过实验测定.

蛋白质：1-100S核酸：10-1000S

病毒：100-1000S细胞核：106-107S

完整细胞：107-108S原核核糖体70S(30S,50S)

第14页/共45页沉清因子k和沉降时间tK因子主要由转子决定。离心时，影响所需的沉降时间。离心分离某一物质所需的离心时间t=K/S试管中，分离所需的时间与距离成正比。K因子小，分离所需的时间更短。K因子还受转速影响，转速高，时间短。第15页/共45页各种离心方法

沉降速度法

差速离心法速度区带离心法

特点:主要按颗粒大小,形状不同分离沉降平衡法

密度梯度离心法（预制梯度，自成梯度）

特点:以颗粒的密度差分离,与大小、形状无关第16页/共45页差速离心法

原理：通过不断增加相对离心力的办法，使一个非均匀混合液内的不同大小、形状的颗粒分步沉淀。第17页/共45页

溶解的细胞（组织匀浆液）

600g离心10min

沉淀（细胞核）上清液（含细胞膜、线粒体、溶酶体核糖体、可溶性蛋白）

10000g离心10min

沉淀上清液（细胞膜、线粒体、溶酶体）（核糖体、可溶性蛋白）

100000g离心3h

沉淀上清液（核糖体）（可溶性蛋白）第18页/共45页速度区带离心法

原理：在离心管预先装入密度梯度材料（如蔗糖，CsCl等），样品铺在梯度液顶部。同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内，达到分离目的。第19页/共45页密度梯度离心法(预制梯度)

在离心之前在管中预先形成线性或非线性梯度,将样品加入离心管中,经长时间平衡离心,使样品颗粒按其密度不同在梯度液中分布,这时颗粒密度等于周围介质的密度ρp=ρm第20页/共45页密度梯度离心法(离心自成)

利用某些重金属盐(如Cscl等)同样品均匀混合,长时间离心.在离心场的作用下,重金属盐重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此时,样品中原先均匀分布的病毒颗粒随周围介质密度的变化而上浮下沉,最终进入与自身浮力密度相同的特定位置,只要转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些颗粒的成带位置.第21页/共45页各类超速离心机转子最高转速允许离心管内平均密度为1.2g/cm3,超过该密度,减速

rpm实际=1.2/实际密度×rpmmax

转子超过寿命也要减速使用转速限制第22页/共45页HBV颗粒分离

1.差速离心分离:HBV阳性血清用缓冲液对倍稀释,4000rpm离心30min后,弃细胞碎片等大沉淀块.上清液再经40000rpm离心3hr,使病毒颗粒沉淀,得到粗病毒液.2.速度区带分离:在离心管中加入70%(w/v)蔗糖2ml,上加20%(w/v)蔗糖4ml,将粗病毒液加在梯度液顶部,于30,000rpm离心4hr.收集20%与70%(w/v)蔗糖中间混浊的中间层.第23页/共45页3.预制梯度等密度离心分离:制备1.0-1.27g/ml/蔗糖密度梯度液,SW41转头100,000g离心24小时后,分部收集.选择合并密度1.2-1.24g/ml管作电镜观察.第24页/共45页预制梯度等密度离心分离:

石蜡油样品0.5ml30%蔗糖2ml40%蔗糖2ml50%蔗糖2ml60%蔗糖2ml70%蔗糖1ml

第25页/共45页梯度液的密度测定1.微量取样器法精密加样器,万分之一或十万分之一秤恒温,用纯水作对照.2.比重称法3.折光仪法(Abbe折光仪)

ρ=an-b

n:液体的折光率a,b:常数随介质而异对温度敏感第26页/共45页第27页/共45页第28页/共45页第29页/共45页第30页/共45页第31页/共45页冠状病毒：+RNA病毒，包膜病毒

75%酒精可以灭活该病毒第32页/共45页第33页/共45