蛋白质结构与功能0905课件

生物化学与分子生物学Biochemistry&Molecularbiology

第一篇

生物大分子的结构与功能Structure&FunctionofBiomacromolecules

生物大分子（Bio-macro-molecules）：

由基本结构单位按一定顺序和方式连接所形成的多聚体。

氨基酸肽键（脱氧）核苷酸3´,5´-磷酸二酯键蛋白质（酶）

核

酸蛋白质研究简史1820~1904发现蛋白质中有20种氨基酸中大部分；1838Berzelius提出“protein”

（源自希腊语proteios,“第一重要的”）1864Hoppe-seyler结晶出第一个蛋白质----卵蛋白；1902E.Fisher表明蛋白质为多肽链；1926Sumner结晶出第一个酶----脲酶；1931吴宪提出蛋白质变性的系统论据和理论（中国）1952Pauling-Corey提出蛋白质的-螺旋和-折叠；1953Sanger胰岛素氨基酸序列分析；1960Kendrew描述了第一个分辨率0.2nm肌红蛋白结构，perutz提出更高分辨率的血红蛋白结构；1965人工合成第一个活性蛋白质--牛胰岛素（中国）蛋白质重要性恩格斯早在一百多年前的《反杜林论》指出：

生命是蛋白体的存在形式，这种存在方式，本质上就在于这些蛋白体的化学部分的不断自我更新。

蛋白体=蛋白质+核酸1.含量高人体固体成分的45%,

脾、肺、肌肉含量均超过80%,细菌的50-80%,干酵母的46.6%。2.种类繁多

生物界蛋白种类估计在10101012数量级蛋白质重要性具体体现在：第一章蛋白质的结构与功能

(StructureandFunctionofProtein)

主要内容一、蛋白质的基本组成单位

二、蛋白质的分子结构

三、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质的理化性质及其分离纯化概述：

第一节蛋白质的基本组成单位2、蛋白质平均含氮量及其应用

1、蛋白质的元素组成2、蛋白质平均含氮量及其应用

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为。1克氮（N）=6.25克蛋白质是凯氏(KJedahl)定氮法测定蛋白质含量的计算基础。16%因此，通过测定生物样品中氮量，即可算出其蛋白质大致含量。hydrolysis(acidorbaseorenzyme)蛋白质的构件分子---氨基酸buildingblocks：aminoacidsprotein第一节蛋白质的基本组成单位一、氨基酸(aminoacids）（一）氨基酸的结构特点

（二）氨基酸的分类(三）氨基酸的理化性质如：胱氨酸羟脯氨酸羟赖氨酸鸟氨酸瓜氨酸同型半胱氨酸

参与蛋白质生物合成的氨基酸1、20种编码氨基酸构成天然蛋白质的氨基酸非体内全部氨基酸非极性疏水性氨基酸7个GlyGAlaAValVLeuLIleIPheFProP氨基酸的表示方法

中文、单字和三字极性中性氨基酸8个SerSCysCTrpWTyrYMetMThrTAsnNGlnQ酸性氨基酸2个AspDGluE碱性氨基酸3个Lys

KArgRHisH氨基酸立体异构体（stereoisomer）

不对称或手性碳原子（asymmetricorchiralcarbons）,

镜像异构体（mirrorimageisomer）或对映体（enantiomer）或光学异构体（opticalisomer）判断：沿HC

键观察，若RNCO顺时针方向为L-型分子；反之则为D-型C*R氨基酸通式：L--氨基酸

H侧链基团(20种)H3N+COO-碳原子相同部分不同部分R-CH-COO-

+NH3H-CH-COO-

+NH3CH-CH-COO-

+NH3CH3CH3通式甘氨酸（Glycine，Gly，G）缬氨酸（Valine，Val，V）HOOC-CH2-CH-COO-

+NH3天冬氨酸（Asparagine，Asp，D）CH2-CH-COO-CH2-+NH2脯氨酸（Proline，Pro，P）

亚氨基酸不同氨基酸差异在于其侧链（R）基团含羟基：Ser、Thr、Tyr

含酰胺基：Gln、Asn含巯基：Cys含硫原子：Cys、Met

含胍基：Arg含羧基：Glu、Asp含咪唑基：His含氨基：Lys——按含有特殊基团：

酸性：Asp、Glu（pI<3.5）

碱性：Lys、Arg、His

（pI>7.5）

非极性、疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、

Phe、Pro

（pI=5~6）极性、中性：Trp、Ser、Tyr、Cys、

Met、Asn、Gln、Thr

（pI=5.0~6.5）

（二）氨基酸的分类——依据侧链的理化性质：Phenylalanine(Phe,F)Proline(Pro,P)非极性疏水性氨基酸(2)NonpolarHydrophobicAminoAcidsGlycine(Gly,G)亚氨基酸无手性碳原子极性中性氨基酸(1)NeutralPolarAminoAcidsSerineThreonineTyrosineCysteine(Ser,S)(Thr,T)(Tyr,Y)(Cys,C)

AsparagineGlutamine(Asn,N)(Gln,Q)Tryptophan(Trp,W)极性中性氨基酸(2)NeutralPolarAminoAcidsMethionine(Met,M)碱性氨基酸BasicAminoAcids

LysineArginineHistidine(Lys,K)(Arg,R)(His,H)酸性氨基酸AcidicaminoacidsAsparticacidGlutamicacid(Asp,D)(Glu,E)其它氨基酸蛋白质中存在的修饰氨基酸在蛋白质中不存在，但为哺乳动物代谢所必需的氨基酸D-氨基酸：抗菌肽等中存在修饰氨基酸常用名

意义同型半胱氨酸

蛋氨酸循环的中间产物

磺酸丙氨酸

半胱氨酸分解的中间产物

同型丝氨酸Thr,Asp,Met代谢的中是产物鸟氨酸

尿素合成的中间产物瓜氨酸

尿素合成的中间产物精氨酸代琥珀酸

尿素合成的中间产物多巴

黑色素的前体

3-碘酪氨酸

甲状腺激素的前体

3，5-二碘酪氨酸

甲状腺激素的前体三碘甲状原氨酸（T3）

甲状腺激素的前体甲状腺素（T4）

甲状腺激素的前体

β-丙氨酸

胞嘧啶，尿嘧啶分解的产物

β-氨基异丁酸

胸腺嘧啶分解的产物

γ-氨基丁酸

抑制性神经递质牛磺酸

胆汁酸的组成成分哺乳动物代谢所必需的氨基酸（二）氨基酸的理化性质两性解离及等电点紫外吸收显色反应（茚三酮反应等）1两性解离及等电点（isoelectricpoint,pI）（1）概念：两性解离（电解质）(amphotericionization)兼性离子（zwitterion）等电点（isoelectricpoint,pI）R-CH-COOHNH2R-CH-COO-NH3+R-CH-COOHNH3+R-CH-COO-NH2+OH-+OH-+H++H+兼性离子pH=pI阴离子pHpI阳离子pHpI

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。等电点（isoelectricpoint,pI)：R基团为非极性基团或基本不电离极性基团的氨基酸的等电点是由-COOH，-NH2的解离常数的负对数pK1、pK2来决定：

pI=(pK1+pK2)/2氨基酸等电点pK1=pK-COOHpK2=pK-NH2pI的计算：pI=½(pk1+pk2)

如：Ala的等电点计算？其pk1=2.34,pk2=9.69pI=½(2.34+9.69)=6.02

酸性和碱性氨基酸，其等电点由-COOH，-NH2和R基团共同决定，只要写出由酸到碱的电离式，然后取兼性离子两边的pK值的平均值。氨基酸等电点则取其兼性离子两边pk值的平均值。

COO-CH2

HC-COO-NH3+COOHCH2HC-COO-NH3+

COO-CH2HC-COO-

NH2COOHCH2HC-COOHNH3++OH-+H++OH-+H++OH-+H+(1.88)(3.65)(9.82)pIAsp=1/2(1.88+3.65)=2.77如：Asp的等电点计算？其pk1=1.88,pkR=3.65，pk2=9.82若氨基酸有3个可解离基团时，？怎么办又如：Lys的等电点计算其pk1=2.18,pk2=8

.95，

pkR=10.53NH3+

(CH2)4HC-COO-

NH2NH3+(CH2)4HC-COO-NH3+

NH2

(CH2)4HC-COO-

NH2NH3+(CH2)4HC-COOHNH3++OH-+H++OH-+H++OH-+H+(2.18)(8.95)(10.53)pI-Lys=1/2(8.95+10.53)=9.74最极端的酸性条件下，向碱性解离方向pK值越小，越先解离

酸性和碱性氨基酸，其等电点由-COOH，-NH2和R基团共同决定，只要写出由酸到碱的电离式，然后取兼性离子两边的pK值的平均值：酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR)/2

碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR)/2氨基酸等电点中性氨基酸的等电点一般在5.0-6.5之间；酸性氨基酸为2.7-3.2，碱性氨基酸为9.7-10.7氨基酸等电点

氨基酸的解离常数与等电点

氨基酸pK1(-羧基)pK2(-氨基)pKR(R基团)pI甘氨酸2．349．60

5．97丙氨酸2．349．696．02缬氨酸2．329．625．97亮氨酸2．369．605．98异亮氨酸2．369．686．02苯丙氨酸1．839．135．48脯氨酸1．9910．966．48半胱氨酸1．968．18

5．07丝氨酸2．219．15

5．68色氨酸2．389．395．89酪氨酸2．209．11

5．66蛋氨酸2．289．215．75苏氨酸2．119．62

5．87谷氨酰胺2．179．135．65天冬酰胺2．028．805．41谷氨酸2．199．674．253．22天冬氨酸1．889．603．652．77赖氨酸2．188．9510．539．74精氨酸2．179．0412．4810．76组氨酸1．829．176．007．59等电点的应用---电泳电泳：带电颗粒在电场中移动的现象称为电泳应用：氨基酸的分离与分析氨基酸不同（pI不同，大小不同），在电场中泳动速度不同，因此可以通过电泳将氨基酸彼此分开当pH=pI时，氨基酸呈兼性离子，在电场中不移动当pH<pI时，氨基酸带正电荷，在电场中向负极移动当pH>pI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动2、紫外吸收蛋白质的定量测定

芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸（TrpTyrPhe）在波长约为280nm处有最大光吸收峰（R基苯环共轭双键）吸收强度比较：Trp>Tyr>Phe应用：由于大多数蛋白质含有Trp，Tyr残基，通过测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，确定生物样品中蛋白质的含量。芳香族氨基酸的紫外吸收光谱TheultravioletabsorptionspectraofthearomaticaminoacidsatpH6.3、氨基酸的呈色反应

茚三酮反应

原理：当茚三酮与一含氨基的分子反应时，除脯氨酸和羟脯氨酸形成黄色化合物外，其他氨基酸都形成一紫色化合物。这种紫色深度与溶液中氨基的浓度成正比，所以能用这反应估量溶液中的氨基酸含量。茚三酮反应——氨基酸的定量测定OCCOCOHOHR

+H2N-CHCOOHR-CHO+CO2加热OCCOC=O+NH3

OCCOC-N=COCCO蓝紫色化合物（=570nm)水合茚三酮还原茚三酮氨基酸的呈色反应

茚三酮反应

应用：适应于氨基酸、多肽和蛋白质的定性和定量分析分光光度计：测定溶液颜色深浅光密度扫描仪:纸上电泳、层析氨基酸小结20种L-α-氨基酸（gly无手性碳原子外，pro为亚氨基酸）为蛋白质构件分子R-侧分类:非极性、极性中性、酸性和碱性记住20种L-α-氨基酸三字母和单字母理化特性：两性电离、紫外吸收、呈色反应

下列是一段由氨基酸组成的序列：

MAGVLKPDEQTRHWY中文名：蛋丙甘缬亮赖脯天谷谷酰苏精组色酪非极性疏水性：甘丙缬亮脯极性中性：蛋谷酰苏色酪碱性：赖精组酸性：天谷280nm：

色酪亚氨基酸：

脯

二、肽（peptide）1888年，阿·亚·丹尼列夫斯基在研究双缩脲反应的基础上提出蛋白质分子中氨基酸间连接为肽键（即酰胺键）的理论。

E.Fischer（1902）人工合成了18肽，进一步肯定了肽链中氨基酸间的连接为肽键。

OOH2N-CH-C-OH+H-N-CH-C-OH

R1

HR2

肽键(peptidebond)

OO

H2N-CH-C-N-CH-C-OH

R1HR2-H2O肽（一）肽键形成（二）多肽链（polypeptidechain）肽链：主链（backbone）

侧链（sidechains）寡肽多肽蛋白质（<10个氨基酸)(<50个氨基酸）（>50个氨基酸)（三）生物活性肽

指生物体内具有各种生物活性的低分子量的肽,在调节代谢、生长、发育、繁殖等生命活动中起着重要作用。如：谷胱甘肽多肽类激素：催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）神经肽：脑啡肽（5肽）、内啡肽（31肽）抗菌肽：短杆菌肽S（10肽）谷胱甘肽（glutathione,GSH）-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸

功能：围绕其-SH的还原性发挥作用重要还原剂:

保护巯基酶和含巯基的蛋白质免遭氧化损伤消除过氧化氢和脂过氧化物使高铁血红蛋白还原恢复血红蛋白的运氧功能解毒功能协助氨基酸的吸收（γ-谷氨酰基循环）功能基团GSH氧化还原作用2GSHGSSGH2O22H2ONADP+NADPH+H+GSHGSH过氧化物酶还原酶或ROOH或ROH+H2O(还原型)(氧化型)多肽类激素神经肽(neuropeptide):Tyr-Gly-Gly-Phe-

MetTyr-Gly-Gly-Phe-

LeuMet-enkephalin:Leu-enkephalin:脑啡肽(enkephalin)抗菌肽(antibacterialpeptide)leuleuD-pheD-pheproproValValOrnOrn短杆菌肽S(gramicidinS)肽小结1、概念：肽键、肽、寡肽、多肽2、多肽链:主链、侧链、氨基末端（N-末端）、羧基末端（C-末端）、氨基酸残基。3、书写要求：N-端（H表示）C-端（OH表示），如脑啡肽：

H-Tyr.Gly.Gly.Phe.Leu-OH

或Y.G.G.F.L

或酪.甘.甘.苯丙.亮

构象（conformation)

：指一类不涉及共价键改变的立体结构问题。如蛋白质的一、二、三、四级结构。构型（configuration)：指一类涉及共价键改变的立体结构问题。如氨基酸的L-型和D-型。第二节蛋白质的分子结构核糖核酸酶A血红素血红蛋白结构示意图四级结构三级结构二级结构一级结构超二级结构（模序）三级结构/亚基结构域蛋白质结构层次及其关系的示意图一、蛋白质的一级结构（primarystructure）

指多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。化学键：肽键、二硫键概念A链

H2N-甘-异亮-缬-谷-谷酰-半胱-半胱-苏-丝-异亮-510

半胱-丝-亮-酪-谷酰-亮-谷-天冬酰-酪-半胱-

1520天冬酰-COOH

ssssB链半胱7ssB链半胱19牛胰岛素A链的一级结构二、蛋白质的二级结构（secondarystructure）（一）概念：

指多肽链骨架上原子的局部空间排布，并不涉及侧链位置。化学键：氢键

（二）肽单元（peptideunit)——组成二级结构的基本单位

指参与构成肽键的6个原子（C1、C、O、N、H、C2）被约束在同一个平面上，C1和C2处平面对角，这样的平面单位称为肽单元（肽平面或酰胺平面）。肽单元0.132nm单键=0.149nm双键=0.127nm肽键=0.132nmByfarthemostcommoncispeptidebondsareX-Prolinkages.Almostallpeptidebondsinproteinsaretrans.TransCisTwoconfigurationsarepossibleforaplanarpeptidebond.ProProTransCisTheangleofrotationaboutthebondbetweenthenitrogenandtheα-carbonatomsiscalledphi().Theangleofrotationaboutthebondbetweentheα-carbonandthecarbonylcarbonatomsiscalledpsi().（三）二级结构的各种形式

1、-螺旋（-helix)0.54nm3.6残基CN-螺旋模型图

肽链呈右手螺旋

每周含3.6个残基,螺距

0.54nm

肽键的H和O间形成氢键

R基团位于螺旋的外侧2、-折叠（-pleatedsheet)肽链呈锯齿状α－碳位于折叠的顶点肽链间借氢键连接可顺向平行或逆向平行侧视图俯视图C-端N-端核糖核酸酶A1234转角模式图3、-转角和无规卷曲NNNNHOCNHOOORRRRHHHHHH型型核糖核酸酶A4、氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响

——蛋白质二级结构是以一级结构为基础。侧链基团同种电荷彼此相斥Pro不能形成氢键侧链基团空间位阻效应（三）模体（motif）和结构域（domain）

指蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为“模体”。1、模体的概念：常见类型蛋白质的超二级结构：模体（motif）发现：多肽链中一些临近的二级结构单元，相互作用，形成有规则的二级结构组合，常有特定功能。1973年RossmanMG首先提出的。作用：属于二级结构与三级结构之间的结构层次，是结构域和三级结构的“建筑模块(module)”；有些有特定功能。常见类型：、、Ca2+-螺旋环CN-螺旋CysCysZn2+HisHisCN蛋白质模体示意图反式作用因子蛋白中的锌指结构钙结合蛋白分子中结合钙离子的模体

有些蛋白质的模体仅有几个氨基酸残基组成，如RGD

(发夹)1、motif的常见组合曲折（-meander）希腊钥匙（Greekkey）Rossman折叠内质网的Ca2＋-ATPase的结构排列(1)螺旋-环-螺旋模体或EF手螺旋E螺旋F几个重要的motif(2)锌指结构(zincfinger)DNAbindingbyazincfingerprotein.ThestructureofafragmentofamousegeneregulatoryproteinboundtoaspecificDNAsite.ThisproteinrecognizesDNAusingthreezincfingersoftheCys-Cys-His-Histypearrangedasdirectrepeats.(3)卷曲螺旋模体或亮氨酸拉链(CoiledcoilmotiforLeucinezipper)Interactionofhomodimericleucine-zipperproteinswithDNA

指在较大蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的模体紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别的局部区域（一般为球状），该区域称为结构域。结构域约含100-200个氨基酸残基，各自有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。结构域（domain）轻链

抗体分子中结构域示意图重链纤连蛋白分子结构域RGDRGD肌钙蛋白C(troponinC)两个独立的钙结合域（calcium-bindingdomain）ABcytochromeb562glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase结构域要点：定义：多肽链上二级结构单元和超二级结构模体以特定方式作用组合，在蛋白质分子中形成一个或多个可明显区分的局部空间结构区域，常具有特定的功能，有时也称功能域（functionaldomain）。由50-350个氨基酸残基构成，蛋白质分子可以有多个相同或不同结构域组合；结构域常对应基因外显子；结构域之间常有一段柔性肽链连接区（铰链区，hinge），与结构域容易发生相对运动有关；结构域之间常形成一裂沟（cleft）或口袋状（pocket），常常是活性部位。三、蛋白质的三级结构（tertiarystructure）定义：指整条多肽链所有原子（主链和侧链）三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步盘曲或折叠所形成的立体结构。作用力：疏水键、离子键、氢键、凡德华力和二硫键等。意义：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质密切相关。Three-dimensionalstructureofmyoglobin(A)Aspace-fillingmodelofmyoglobinwithhydrophobicaminoacidsshowninyellow,chargedaminoacidsshowninblue,andothersshowninwhite.Thesurfaceofthemoleculehasmanychargedaminoacids,aswellassomehydrophobicaminoacids.(B)Across-sectionalviewshowsthatmostlyhydrophobicaminoacidsarefoundontheinsideofthestructure,whereasthechargedaminoacidsarefoundontheproteinsurface.Howaproteinfoldsintoaglobularconformation.

疏水残基避免与水接触是驱使二级结构单元形成特定三级结构的主要动力未折叠多肽链在水环境中折叠构象极性侧链在分子表面与水通过氢键结合疏水残基藏于分子内部形成疏水核非极性侧链极性侧链蛋白质三级结构要点定义：指整条多肽链所有原子（主链和侧链）三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步盘曲或折叠所形成的立体结构。作用力：疏水键、离子键、氢键、凡德华力和二硫键等。意义：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质密切相关。球状蛋白三级结构特征：多层次模块化装配：多种二级结构单元超二级结构（模体）结构域三级结构；密度不均：大部分紧密球状或椭球状实体中有低密度松散区（-转角、无规则卷曲、loop等）内疏外亲：大部分球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面是最稳定结构（膜内蛋白例外），隐藏疏水残基避免与水接触是安排二级结构单元形成特定三级结构的主要动力；球状蛋白表面常有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋），空穴周围分布着许多疏水侧链，为底物等发生化学反应营造一个疏水环境（低介电区）。空穴大小约能容纳1~2各小分子配体或大分子的一部分。四、蛋白质的四级结构quaternarystructure链链血红素Quaternarystructureofhemoglobin

HbA

天冬氨酸乳酸大肠杆菌谷氨酸转甲酰酶脱氢酶RNA聚合酶脱氢酶亚基数

412456代号

22C6R6MnH4-n2’亚基相同分子量

6.431.015.050.033.5一些具有四级结构蛋白质的亚基组成蛋白质的四级结构要点：定义：有两条或两条以上独立三级结构的多肽链彼此通过次级键结合而形成的空间结构。亚基（subunit）：四级结构蛋白中，具有独立三级结构的多肽链。故四级结构实际是亚基的立体排列和相互作用。寡聚蛋白：同源多聚体、异源多聚体作用力：疏水键、离子键、氢键寡聚蛋白中，单独亚基一般没有功能，只有完整四级结构才有生物学功能

降低比表面积，增加蛋白质的稳定性丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。提高基因编码的效率和经济性。使酶的催化基团汇集，提高催化效率。亚基的超级聚合体：丝、片、球和管道等形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。具有协同效应和别构效应，实现对酶活性调节.四级缔合在结构和功能上的优越性一级结构是蛋白质空间结构的基础，蛋白质趋向形成一种能量最低，结构最稳定的三级结构，这是蛋白质能折叠的动力；细胞内高稠密介质，以及狭窄空间使得伸展和部分折叠的蛋白质在高浓度时倾向于聚集；无法自我迅速完成正确折叠蛋白质的折叠问题两大类蛋白质参与蛋白质折叠：蛋白质二硫键异构酶（proteindisulfideisomerase,PDI）:加速蛋白质折叠过程中形成正确配对二硫键；分子伴侣（molecularchaperone）:为蛋白质折叠提供一个有利的折叠环境，与未折叠肽段的疏水部分可逆结合，防止聚集和错误折叠，诱导正确折叠。如热休克蛋白（heatshockprotein）等hsp70和hsp40参与新生肽的正确折叠（1）新生肽的折叠ribosomehsp70hsp70正确折叠蛋白质不正确折叠蛋白质分子伴侣hsp60家族结构与功能.该家族又称伴侣素（chaperonin）,主要成员包括线粒体内的hsp60,细胞质的TCP-1和细菌的GroEL

（2）错误折叠蛋白的重折叠GroELGroEScapHsp60蛋白复合物疏水蛋白结合位点不正确折叠蛋白质正确折叠蛋白质的释放蛋白质的分类1、组成分类：单纯蛋白：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、硬蛋白和植物谷蛋白等。结合蛋白：单纯蛋白+非蛋白（辅基）核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、色蛋白和金属蛋白等2、溶解度分类：可溶性蛋白、醇溶蛋白和不溶性蛋白3、分子形状分类：

球状蛋白和纤维蛋白第三节蛋白质结构与功能的关系牛胰核糖核酸酶一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础-巯基乙醇及尿素对牛胰核糖核酸酶的作用268440659558110721101109595262640407272656558588484124（二）一级结构与功能关系

1、一级结构相似，其空间构象以及功能也相似哺乳类动物胰岛素氨基酸序列的差异A8A8A9A9ACTH、-MSH和-MSH一级结构的比较ACTH-MSH-MSH不同的激素呈现相似功能前胰岛素原剪切成胰岛素示意图2、一级结构与前体蛋白质的加工蛋白质序列进化

——分子进化速率时标[10-9/（氨基酸.年）]3、一级结构与物种进化

狗人猴

马骡

鲸兔猪袋鼠企鹅鸡鸭响尾蛇龟苍蝇蛾脉孢菌属念珠菌属面包酵母菌小麦牛蛙金枪鱼动物爬行动物两栖动物鱼哺乳动物鸟昆虫植物脊椎动物从细胞色素C的一级结构看生物进化4、一级结构与分子病DNA……TGTGGACTCCTCTTT……mRNA……ACACCUGAGGAGAAA……N…—Thr—Pro—Glu

—Glu—Lys—…DNA……TGTGGACCCTTTTT……mRNA……ACACCUGGGAAAAA……N…—Thr—Pro——Glu—Lys—…镰刀状红细胞性贫血血红蛋白遗传信息的异常HbA（亚基）正常Hbs（亚基）异常AUVal二、蛋白质空间结构与功能的关系

以血红蛋白（hemoglobin，Hb）结构与功能为例：（一）肌红蛋白（myoglobin，Mb）和血红蛋白的结构

三级结构单链蛋白质，呈球状；8个区段为-螺旋，区间为无规卷曲；分子内部有袋形孔穴，血红素居中，Fe2+与F8的His形成配位键。肌红蛋白结构1、肌红蛋白结构NNNNFeH3C--CH3-CH=CH2CH2CH2COO-CH2CH2COO-H3C-H2C=CH血红素结构2、血红蛋白结构四级结构球状蛋白质：

HbA（成人）22

HbF（胎儿）22Hb（胚胎）22

亚基间形成八对盐键，每个亚基容纳一个血红素。肌红蛋白与血红蛋白的氧解离曲线（二）血红蛋白的构象变化与结合氧

1、氧解离曲线2、协同效应（cooperativity)：

指一个亚基与其配体（Hb的配体为O2）结合后，能依次影响寡聚体中另一个亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则称为正协同效应（positivecooperativity)；反之称为负协同效应（negtivecooperativity）。3、别构效应（allosterism)

HbT态和R态互变11122221T型(紧张态)R型(松弛态)1122151221

通常，蛋白质分子与它的配体（或其它蛋白质分子）结合后，其构象要发生变化，使它更适合（或更不适合）于功能需要，这样的变化称为别构效应。结合氧氧解离Hb氧合与脱氧构象转换示意图血红素与O2结合后的构象变化（三）蛋白质构象改变与疾病构象病：

蛋白质错误折叠，尽管其一级结构不变，但构象和功能改变，严重时导致的疾病。疯牛病

——朊病毒蛋白（prionprotein,PrP）引起的人和动物神经退行性病变，并具有传染性、遗传性或散在发病特点。

第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。等电点（isoelectricpoint,pI)：（二）蛋白质的胶体性质蛋白质溶液稳定的二大因素

1、分子表面的水化膜

2、分子表面同种电荷的排斥力（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

1、变性（denaturation）和复性（renaturationg）（1）概念：

在某些理化因素的作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物学活性的丧失，称为“变性”。变性：变性的本质：分子构象的改变

在去除变性因素后，有些蛋白质又可恢复或部分恢复其原有的构象和生物学功能，称为“复性”。

复性：蛋白质变性是可逆的，但复性是有条件的蛋白质从溶液中析出的现象称为“沉淀”。溶解度降低粘性增加结晶性能减弱易被蛋白酶水解（2）变性后蛋白质性质的改变：2、蛋白质的沉淀反应（1）盐析（saltingout）在蛋白质溶液中加入大量中性盐以破坏其胶体稳定性而使蛋白质析出，这种方法称为“盐析”。

分段盐析：（2）重金属盐沉淀蛋白质(pH>pI)（3）生物碱试剂沉淀蛋白质(pH<pI)（4）有机溶剂沉淀蛋白质(pH=pI)（5）加热沉淀蛋白质(pH=pI)常见的蛋白质沉淀方法：3、蛋白质的凝固作用蛋白质变性、沉淀和凝固的关系

变性蛋白质不未定，易沉淀，但不一定沉淀。凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。1、茚三酮反应蛋白质+水合茚三酮蓝色化合物2、双缩脲反应蛋白质+硫酸铜（NaOH）紫红色化合物3、米伦氏反应蛋白质+米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞和硝酸的混和液）红色沉淀物（加热后）（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应二、蛋白质的分离和纯化

一般步骤:样本选择和预处理粗品制备（组织或细胞破碎和离心）初步分离提纯进一步纯化鉴定和定量（一）透析（dialysis）及超滤法（ultra-filtration）（二）电泳（electrophoresis）（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（Immuno-precipitation）（四）层析（chromatography）：离子交换层析

亲和层析分子筛层析（凝胶过滤，gelfiltration）（五）超速离心（ultra-centrifugation）常用技术离子交换层析分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质透析电泳三、多肽链中氨基酸序列分析

（一级结构测定）第一步：氨基酸组分分析第二步：肽链氨基末端和羧基末端测定第三步：酶解肽段分析，寻找重叠肽段（一）氨基酸组成分析

1、纯化样品（先拆离亚基）

2、水解样品

3、氨基酸自动分析仪洗脱体积吸光度离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分（二）测定肽链的N-末端和C-末端氨基酸（肽链头）

N-末端C-末端化学法二硝基氟苯（DNP法）肼解法二甲基氨基奈磺酰氯法还原成氨基醇法（Dansyl-氯法）异硫氰酸苯酯法（IPTC法）酶解法亮氨酸氨肽酶法羧肽酶A法细胞外氨肽酶法羧肽酶B法氨基酸和肽的末端测定法1、N-末端氨基酸的分析

（1）二硝基氟苯法（DNP法、

Sanger法）:

2,4-二硝基氟苯(FDNB)与N端-氨基进行烷化反应，生成二硝基苯衍生物（DNP-肽）,酸水解得到黄色DNP-氨基酸,并可用乙醚抽提再进行色谱分析。（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,FDNB）（2）丹酰氯法（Dansyl-氯法）：

荧光试剂丹酰氯（二甲基氨基奈磺酰氯）与非解离-NH2

作用,进一步水解后可得到丹酰-氨基酸（DNS-氨基酸）在360nm或280nm处产生强烈荧光。（3）异硫氰酸苯酯法（IPTC法、Edman降解法）：C6H5-NCS

+ONH2-CH-C-NH-RR1C6H5-NCS-HONH-CH-C-NH-RR1C6H5-NH-CN+HSCH-R1

CO

C6H5-NH-CS-NH-CH-COOHR1加成NH2-RH+H2OH+H2OH+SCNHNCH-R1

COC6H5-异硫氰酸苯酯（PITC）肽（I）苯氨基硫甲酰基肽（PTC-肽）苯氨基硫甲酰基氨基酸（PTC-氨基酸）肽（II）2-苯氨基-5-噻唑啉酮苯乙内酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）（在268nm处有强吸收峰）异硫氰酸苯酯法

（IPTC法，Edman降解法）2、C-末端氨基酸的分析

(1)羧肽酶法:

羧肽酶A

水解脂肪或芳香族氨基酸的C-末端。羧肽酶B

水解碱性氨基酸的C-末端,定期取样分析,以先后顺序排列。(2)肼解法:

与肼反应后仅C-末端氨基酸游离，其它则与苯甲醛沉淀。肼解法反应过程（三）酶解肽段分析、寻找重叠肽段

1、酶解（两种以上方法）和肽片段分离纸电泳方向纸电泳方向点样酶解肽片段分离

——人血红蛋白双向肽图2、各肽片段序列分析（常用Edman降解法，也称PITC法）4、确定二硫键位置。R-L-G-A-KE-W-G-Y-C-M-QR-S-P-FG-Y-C-M-QR-L-G-A-K-R-SP-F-E-W第1套酶切法第2套酶切法第1套酶切法的产物：第2套酶切法的产物：R-L-G-A-K-R-S-P-F-E-W-G-Y-C-M-Q（16肽）3、重叠肽法推定肽链的氨基酸序列。例如：四、蛋白质空间结构测定圆二色光谱（circulardichroism,CD）：测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量（尤其是-螺旋）X-射线衍射法（X-raydiffraction）：即X-射线穿过蛋白晶体的一系列平行剖面所表示的电子密度图，经计算机处理绘制出三维空间电子图。磁共振技术（二维磁共振）:一、20种氨基酸的结构、分类和代号二、肽键和肽链（主要是结构特点）三、蛋白质的分子结构及其与功能的关系：

1、肽单元（概念、特点）

2、蛋白质分子各层次的结构（构象）

3、稳固蛋白质分子三维结构的化学键

4、一级结构和空间结构与功能关系

5、分子结构测定的方法四、蛋白质的重要理化性质及其与分离纯化的关系小结重要知识点：性质功能序列测定空间结构测定分离纯化结构与功能的关系空间结构蛋白质性质氨