生物化学与分子生物学：第14章 DNA的生物合成

第十四章DNA的生物合成DNAReplication11.DNA与染色体---DNA高度盘绕成基因组原核生物DNA真核生物染色体DNA2.DNA的结构

DNA的生物合成又称DNA复制。

复制（replication）是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板，按照碱基配对原则指导合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA本章主要内容DNA复制的基本特征DNA复制的酶学和拓扑学变化原核生物DNA复制过程真核生物DNA的生物合成过程逆转录和其他复制方式

第一节

DNA复制的基本规律

DNA复制的方式为半保留复制

(semi-conservativereplication)

DNA复制的形式为双向复制

(bidirectionalreplication)

DNA复制的过程为半不连续复制

(semi-discontinuousreplication)7

一、DNA以半保留方式进行复制（semiconservativereplication）

DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律合成与模板互补的子链，形成子代DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则是合成的，故称半保留复制。

8AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式:

全保留式半保留式混合式10半保留复制的实验依据

1958年，Messelson和Stahl用实验证实。

1、把细菌放在含15NH4Cl的培养液中培养若干代，密度梯度离心分离出DNA是含15N的重DNA。

2、把含15N-DNA的细菌放14NH4Cl普通培养液中培养。子一代的DNA是中等密度DNA

。

3、继续培育出子二代，其DNA则是中等密度DNA与普通DNA各占一半。

DNA半保留复制的实验证据含N15-DNA的细菌培养于14NH4Cl培养液

第一代

第二代梯度离心结果培养于14NH4Cl培养液重DNA普通DNA中等密度DNADNA半保留复制的意义按半保留复制的方式，子代保留了亲代DNA的全部遗传信息，体现了遗传过程的相对保守性。遗传的保守性是相对的，而不是绝对的。自然界还存在着普遍的变异现象。DNA复制时，从复制起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、DNA复制从起点的两个方向延伸-双向复制(bidirectionalreplication)

原核生物是单点起始双向复制。其环形DNA为单复制子，只有一个复制起始点。真核生物是多复制子双向复制。其线形DNA有多个复制起始点，形成多个复制子。（复制子是独立完成复制的功能单位，一个复制起始点起始的DNA复制区域称为复制子replicon）。16原核生物的DNA双向复制形成θ结构17A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC原核生物DNA复制185’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’真核生物DNA复制19三、DNA复制反应呈半不连续性355解链方向3´5´前导链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)3´3´5´冈崎片段20DNA合成酶只能催化DNA链从5到3端

前导链(leadingstrand)

：复制方向与解链方向一致的子链。领头链复制是连续的。

后随链(laggingstrand)

：复制方向与解链方向相反的子链。随从链的复制是不连续的，形成多个冈崎片段。冈崎片段（Okazakifragment）：1968年，日本科学家冈崎用电镜观察到，原核生物大小在一千至二千核苷酸范围，真核生物数百个核苷酸。复制中不连续的DNA片段。21第二节

DNA复制的酶学和拓扑学变化

参与DNA复制的酶与物质：

1、模板(template)底物

2、

dNTPs（N:A,G,C,T）3、解螺旋酶（解链酶）（helicase)4、拓扑异构酶（topoisomerase)5、单链DNA结合蛋白SSB6、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNA-pol)7、引物酶（primase)8、引物（primer)9、DNA连接酶（ligase)10、其他因子1、复制的基本化学反应：核苷酸和核苷酸之间，通过3`,5`磷酸二酯键的生成而逐一聚合。反应底物是dNTP，加入单链的是dNMP。（dNMP）n+d(NTP)（dNMP）n+1+PPi2、复制的方向性：新链只能从5`-端向3`-端延长（所有新生成的RNA或DNA单链其方向都是5`→3`，模板链与之反向互补平行）。3`3`5`5`模板链新生链复制的化学反应

253`,5`磷酸二酯键的生成

一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合

（DNA-depeendentpolymerase,DNA-pol)

全称：依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentpolymerase)

简称：DNA-pol活性：5`→3`聚合活性

外切酶活性DNA聚合酶的多种活性5´

AGCTTCAGGATA

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除引物及突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。3´

（一）原核生物的DNA聚合酶

DNA-polIDNA-polII

DNA-polⅢ

原核生物的DNA聚合酶1、DNA-polⅢ：

结构：由10种亚基组成的不对称异聚合体。其中αεθ组成核心酶。功能：①真正的复制酶，α亚基具聚合活性。②ε亚基有3`→5`核酸外切酶活性和碱基选择功能。２个核心酶(α、ε、θ)1个-复合物（、、、、、

6种亚基）1对-亚基（可滑动的DNA夹子）全酶结构包括：2、DNA-polII

有3`→5`核酸外切酶活性和聚合酶活性，对模板要求不高主要参与DNA损伤的应急状态修复（SOS修复）。3、DNA-polI

单一肽链的大分子，二级结构以α-螺旋为主，从A至R共18个α-螺旋肽段。I螺旋与O螺旋之间有较大的空隙，可容纳DNA链。小片段：A—F螺旋区大片段（Klenow片段）：G—R螺旋区polIDNA-polI作用：切除引物和突变片段；

（5`→3`核酸外切酶活性）复制和修复中的空隙填补；

（DNA聚合酶活性）复制中的错误校读。

（3→5`核酸外切酶活性）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是分子生物学常用的工具酶。

35

（二）真核生物的DNA聚合酶

DNA聚合酶主要有5种。

DNA-polα：起始引发，有引物酶活性

DNA-polβ：参与低保真复制

DNA-polγ：线粒体DNA复制酶

DNA-polδ：延长子链的酶，有解螺旋酶活性

DNA-polε：校对、修复、填补去除引物的缺口真核生物的DNA聚合酶真核生物的DNA聚合酶真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较E.Coli真核细胞

功能DnaG引物酶Ⅱ低保真复制，DNA修复线粒体DNA合成Ⅲ前导链和后随链合成，解旋酶Ⅰ校对和填补缺口线粒体DNA合成（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择利用“错配”实验发现，DNApolⅢ对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。二、DNA聚合酶的碱基选择和校对

功能实现复制保真性Poly（dA）21引物Poly(dT)20dT,dA,dG,dCDNA合成体系Poly（dA）21引物Poly(dT)20dT,dA,dG,dCDNA合成体系（无ε亚基）21位上：dT21位上：dA,dG,dC,dT错配实验DNApolⅢ对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。原核生物DNA-polI、真核生物DNA-pol和真核生物DNA-pol具有3`→5`外切酶活性，可以在复制过程中辨认并切除错配的碱基，对复制错误进行校正，这个过程叫错配修复（mismatchrepair）。（二）DNA聚合酶的核酸外切酶活性辨认切除错配碱基并加以校正（即时校读功能）

DNA复制的保真性，依赖三种机制：

①

遵守严格的碱基配对规律;②

聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能;③

复制出错时有即时的校读功能。

三、复制中的解链伴有DNA分子

拓扑学变化DNA分子的碱基埋在螺旋内部，只有解成单链才能发挥模板作用

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态蛋白质（基因）通用名功能DnaA(dnaA)辨认复制起始点DnaB(dnaB)解旋酶解开DNA双链DnaC(dnaC)运送和协同DnaBDnaG(dnaG)引物酶催化RNA引物合成SSB单链结合蛋白稳定已解开的单链DNA拓扑异构酶拓扑异构酶Ⅱ解开超螺旋原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质

复制起始时DnaA辨认E.coli上复制起始点oriC（originC），DnaC辅助DnaB(解螺旋酶)结合起始点并打开双链。（DnaADnaBDnaC分别是dnaAdnaBdnaC基因产物)。E.coli基因图E.Coli基因图解旋酶（helicase）又称DnaB，其作用是利用ATP供能来解开DNA双链。单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。复制过程中不断与单链DNA结合和脱离。引物酶（primase）又称DnaG，作用是催化形成短片段的RNA引物，在其3`-OH端开始复制。

(二)DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）

拓扑：指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。复制解链中的DNA分子绕双螺旋轴高速解链旋转（旋转100次/秒），会造成解链前方的DNA分子缠绕打结，通过拓扑异构酶的作用，以改变DNA分子拓扑构象，解除DNA分子缠绕打结。

108局部解链后复制过程正超螺旋的形成：拓扑异构酶作用特点：既能水解，又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类：拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：作用：连接DNA单链3`-OH末端和相邻DNA单链的5`-P末端,使二者生成3`，5`-磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA单链连成完整的链，需ATP。图四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口（DNAligase）HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’POO-O-OPOO-O-O提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较

第三节原核生物DNA复制过程

一、复制的起始需要解决两个问题(一)DNA解链，提供模板(二)合成引物，提供3-OH，形成引发体(一)DNA解链，提供模板复制起始点结构：E.coli固定的复制起始点OriC跨度为245bp，包含有3组串连重复序列和2对反向重复序列。E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列5353（一）

DNA的解链E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列53531.固定起始点原核生物的复制起始部位及解链

复制起始过程：

DnaA辨认结合于OriC重复序列，DnaC辅助DnaB结合于OriC附近，解开局部双链

，置换出DnaA，DnaG（引物酶）进入，形成引发体。继续解链，SSB结合保护解开的单链，拓扑异构酶发挥作用，引物酶催化生成RNA引物，复制起始完成。2.DNA解链需多中蛋白质参与35DnaCDnaBDnaG35oriCDnaB,DnaC,DnaG与OriC共同形成引发体（二）引物合成和引发体形成3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶3535引物5'SSBDnaB引物酶5'复制延长拓扑异构酶5'聚合酶

二、复制的延长

复制的延长是在DNA-polⅢ催化下以dNTP为原料，以dNMP方式逐个加入到引物或延长中的新链3`-OH末端上，逐个形成3`,5`-磷酸二酯键,复制方向5`→3`，复制特点：半不连续性复制。图1图2DNA复制速度相当快，E.coli20分钟可繁殖一代，每秒可参入2500个核苷酸。5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。后随链的合成复制延长过程555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA连接酶子链上不连续性片段的连接复制过程简图5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5→3方向可以连续地延长。后随链的合成

在复制叉同时合成前导链和后随链复制过程简图三、复制的终止：切除引物、填补空缺、

连接缺口

原核生物环状DNA采取单复制子双向复制。领头链和随从链上的RNA引物被RNA酶（或DNA-polI）水解，空隙由DNA-polI来催化填补，DNA连接酶将各片段连接成完整的环状新链，形成两个完整的环状DNA。

ori5`3`原核生物复制终止terterori3`3`5`5`5`3`3`5`3`5`555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATP

ADP+Pi55DNA连接酶子链上不连续性片段的连接（动画7）53355335+53333555（动画7）细胞周期DNA合成期G1G2SM第四节真核生物的DNA生物合成

细胞周期可分为：S期（Syntheticphase,DNA合成期）G2期（GapⅡ,DNA合成后期）M期（mitoticphase,有丝分裂期）G1期（GapⅠ,DNA合成前期）DNA在每个细胞周期只复制一次1.

真核生物DNA复制是多复制子双向复制，有多个起始点；2.

复制有时序性，复制子以分组方式激活而不是同步起动；一、复制的起始

真核生物复制起始与原核生物基本相似，有以下特点：3.复制起始点序列较原核oriC短。酵母复制起始点含11bp的自主复制序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)。4.DNA-polα具引物酶活性，DNA-polδ具解螺旋酶活性。5.增殖细胞核抗原(PCNA)参与复制起始。其作用与原核DNA-polⅢ的β亚基相似，形成钳卡DNA的夹子。二、复制的延长真核生物复制延长与原核生物基本相似，有以下特点：1、DNA-polα生成引物（RNA+小段DNA）。2、DNA-polδ在增殖细胞核抗原PCNA协助下合成DNA子链。3、引物和冈崎片段较原核生物短，单个复制子复制速度慢，但总体速度不慢。3553前导链3535亲代DNA后随链引物核小体三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体四、端粒酶参与解决染色体末端复制

1、真核生物复制终止真核生物复制终止与原核生物基本相似。不同点：DNA为线形，复制结束时两条新生子链的5`端的引物切下后形成的空隙需端粒酶修补并形成端粒。线性DNA复制的末端5`3`端粒酶RNA5`3`3`OH5`3`逆转录反折5`DNA-polε，连接酶TTTGGGTTTGG-OH3`AAACCCAAACCCAAACCCTTTGGGTTTGGGTTTGGG-OH3`AAACCCAAACCCAAACCC端粒酶RNA2、端粒（telomere）是真核生物染色体线性DNA分子末端的膨大的粒状结构，由DNA和结合蛋白形成。在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性有重要作用。

端粒DNA序列共同特点是富含T、G短序列的重复序列(TnGn)x3、端粒酶(telomerase)

是一种RNA-蛋白质复合物。

端粒酶RNA

(AnCn)x

端粒酶协同蛋白端粒酶逆转录酶端粒酶端粒酶以其RNA为模板，在其协同蛋白参与下，其逆转录酶催化生成DNA单链。端粒酶借助其RNA与DNA单链有互补碱基序列而辨认结合。以RNA为模板的逆转录，进行母链DNA的延长。延长以后的单链反折，DNA-polε以其3`-OH末端复制DNA单链，填补引物切除后的缺失，DNA连接酶完成连接。

端粒酶（TBP）类似于反转录酶，其中的RNA与DNA