化学检测技术

化学检测技术1第1页，课件共40页，创作于2023年2月一、糖类的化学检测糖类包括多糖、双糖、单糖单糖和某些双糖具有游离羰基——还原糖多糖和蔗糖等无还原性——非还原糖糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。非还原糖必须转化为还原糖再进行测定2第2页，课件共40页，创作于2023年2月最常用的试剂：斐林（Fehling）试剂基本组成：

A：CuSO4溶液

B:NaOH和酒石酸钾钠溶液使用时A、B等体积混合(生成酒石酸钾钠铜）酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定。3第3页，课件共40页，创作于2023年2月定糖常用方法1、兰—爱农（Lane-Eynon）法次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、（置换法、直接滴定法）反应终点用次甲基蓝指示剂显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1D还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解4第4页，课件共40页，创作于2023年2月操作要点（1）斐林试剂的标定（a）标定预备试验

A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）标定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（V1-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V05第5页，课件共40页，创作于2023年2月(2)定糖（a）定糖预备试验

A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖

A、B各5mL＋10mL样品糖液（250mL三角瓶中）摇匀，补加（V0-V2）mL水，并从滴定管中预先加入（V2-1)mL标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，＋2D1％次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在1min内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数V。6第6页，课件共40页，创作于2023年2月

(3)计算还原糖含量（以葡萄糖计）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分开储存，防止Cu++变化，临用混合（b）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净（c）体积需控制在一定范围内，对pH有影响（d）煮沸时间要一致（e）注意指示剂加入时间和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min内完成）（g）产物Cu2O不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热

7第7页，课件共40页，创作于2023年2月斐林试剂快速法：在斐林试剂中加入亚铁氰化钾（黄血盐）反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰－爱农法更为明显。8第8页，课件共40页，创作于2023年2月2、碘量法I2→NaIO(氧化剂）其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应操作要点：（1）标准硫代硫酸钠溶液配制，0.05mol/L，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。（2）标准碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘9第9页，课件共40页，创作于2023年2月碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，摇匀后暗反应15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录V0(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1(5)计算：醛糖含量＝（V0

－V1）C×M×n注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如：果糖）10第10页，课件共40页，创作于2023年2月3、铜试剂法

将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。（1）铜试剂的配制主要提供二价铜离子及碘（2）标准曲线的制作11第11页，课件共40页，创作于2023年2月(a)标准葡萄糖液的配制

0.1%或0.05％（根据所用铜离子试剂定）(b)三角瓶编号123456

葡萄糖标准液（mL)012345

蒸馏水（mL)543210

铜试剂（mL)555555

沸水浴10min，冷却至室温,(c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振荡，待红色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量V(d)绘标准曲线葡萄糖含量（mg）为纵坐标，（V0-V)为横坐标12第12页，课件共40页，创作于2023年2月二、蛋白质和氨基酸的化学检测蛋白质含氮量几乎恒定，平均16％测出N含量×6.25，即为蛋白质量eg：

含氮量每克N相当蛋白质量

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鲑精蛋白31.5％3.1713第13页，课件共40页，创作于2023年2月蛋白质常用检测方法1、定氮法（经典的，仲裁的）

凯氏定氮法或微量凯氏定氮法（1）原理消化、蒸馏、吸收、滴定计算（2）操作要点

(a)消化：目的：使样品中的蛋白质分解，其中氮与硫酸反应生成(NH4)2SO4

凯氏定氮瓶，样品＋K2SO4-CuSO4、浓H2SO4,通风厨内进行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。14第14页，课件共40页，创作于2023年2月15第15页，课件共40页，创作于2023年2月(b)蒸馏：目的：碱化蒸馏使氨游离。加10～50ml30%氢氧化钠，防止漏气。(c)吸收：5mL2％H3BO3吸收或一定量标准酸溶液（如25mL0.05mol/LH2SO4)＋甲基红－溴甲酚绿几滴(d)滴定计算：若H3BO3吸收：0.01mol/LHcl滴定至绿色→淡紫红色样品中的总氮量（mg)=（A-B)×C×14×n

若标准硫酸接收：0.1mol/L标准NaOH滴定，甲基红→黄色终点样品中总氮量=（C1V1-C2V2)×14×n粗蛋白含量＝样品的总氮量×6.2516第16页，课件共40页，创作于2023年2月2、双缩脲试剂法蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应：蛋白质（多肽）＋CuSO4→（NaOH）→铜－钠双缩脲络合物（紫红色络合物）A∝Cp，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关Tris缓冲液干扰P的测定，测定范围1～10mg/mL17第17页，课件共40页，创作于2023年2月操作：（1）双缩脲试剂的配制

CuSO4、酒石酸钾钠、NaOH、0.1%KI(2)标准曲线的制作1％标准酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20双缩脲试剂(mL)444444室温反应30min测A540(3)样品测定：

1mL＋4mL双缩脲试剂，30min，测A54018第18页，课件共40页，创作于2023年2月3、福林－酚试剂法是双缩脲法的发展，灵敏高100倍，需时较长，而且对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。原理：（1）碱性铜试剂——双缩脲反应（2）稀释的苯酚试剂——与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色（3）两种呈色反应可叠加19第19页，课件共40页，创作于2023年2月操作：（1）福林－酚试剂的配制甲液：碱性铜试剂（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸钾钠)

乙液：稀释的苯酚试剂（2）标准蛋白溶液配制结晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）（3）标准曲线制作（4）样品测定

1mL样品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室温10min，＋乙液0.5mL，混匀，室温30min，测A500~75020第20页，课件共40页，创作于2023年2月氨基酸含量测定方法1、茚三酮显色法

微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物。蛋白质、多肽和氨基酸均可发生印三酮反应。取1mL样品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL缓冲液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮显色液，100℃

水浴15min，自来水冷却后，加入3mL60％乙醇溶液，测定OD570，脯氨酸或羟脯氨酸测OD44021第21页，课件共40页，创作于2023年2月2、甲醛滴定法氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定。加甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定。注意：需用过量中性甲醛。22第22页，课件共40页，创作于2023年2月三、核酸的化学检测根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测。1、定磷法（1）核酸的消化（2）磷的测定定磷试剂，45℃水浴25min，冷却至室温测OD650

无机磷标准液作标准曲线（3）核酸含量的计算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.9DNA量＝（总磷量－无机磷量）×10.523第23页，课件共40页，创作于2023年2月2、二苯胺法测定DNA含量DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收峰。在40～400μg范围内，OD595与DNA浓度成正比。（1）二苯胺试剂的配制（2）标准曲线制作（3）样品DNA含量测定24第24页，课件共40页，创作于2023年2月3、地衣酚法测定RNA含量

RNA在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与3，5－二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，OD670与RNA浓度成正比。所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如DNA）。操作：地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品RNA测定25第25页，课件共40页，创作于2023年2月三、蛋白质的免疫化学检测

利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析技术。一、抗原-抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。

反应的特点：

可逆性

最适比例

特异性

敏感性26第26页，课件共40页，创作于2023年2月（1）凝集反应效价测定，细菌、病毒分类（2）沉淀反应沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等（3）免疫标记二、蛋白质的免疫化学检测方法27第27页，课件共40页，创作于2023年2月

1、凝集反应

凝集反应（agglutination）是指细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝聚物。其中参与反应的抗原称为凝集原，其抗体称为凝集素。28第28页，课件共40页，创作于2023年2月直接凝集：细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现凝集现象。间接凝集反应：将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应出现颗粒物凝集现象。

间接凝集抑制试验：将待测抗原与特异性抗体先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液。若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应出现的凝集现象被抑制。29第29页，课件共40页，创作于2023年2月30第30页，课件共40页，创作于2023年2月

2、沉淀反应可溶性抗原沉淀反应（precipitation）:可溶性抗原与相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。包括：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋白分子等。反应特点：比例性包括：沉淀试验、界面试验、免疫扩散（单向免疫扩散、双向免疫扩散）、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光31第31页，课件共40页，创作于2023年2月沉淀试验界面试验32第32页，课件共40页，创作于2023年2月33第33页，课件共40页，创作于2023年2月3、免疫标记免疫标