溶藻弧菌的分类鉴定与致病因子研究

溶藻弧菌的分类鉴定与致病因子研究

专业嗜盐性弧菌是一种稀有的嗜盐性弧菌，它引起了许多珍贵的经济鱼类，如牙齿和日本鱼，并威胁到中国的水产养殖发展。这一大规模的疾病给描绘和治疗该地区渔业和水产养殖带来了巨大的经济损失。溶藻弧菌过去一直被认为不致病或仅能引起部分创伤性感染而未受到重视,近年研究证实该菌与副溶血弧菌一样,是沿海地区腹泻病和食物中毒的常见病原菌[2~3]。尽管发现海产品中的溶藻弧菌对人具有致病性,但是目前还没发现有对海产品中溶藻弧菌引起食物中毒的关键致病因子及其毒力基因的详细报道。本实验从不同海产品中筛选溶藻弧菌,并对其致病因子进行了研究,为随后毒力基因的研究作准备。1材料和方法1.1材料表面扇贝、牡蛎、贻贝、沙虾、虾蛄等购于广州市石牌东菜市场。1.2提式压力蒸汽灭菌器,广东医疗设备厂超净工作台(SW-CJ-1BU单人单面净化工作台苏州净化设备优先公司),自封手提式压力蒸汽灭菌器(广东医疗设备厂),恒温摇床(SHZ-82,常州国华电器有限公司)。1.3试剂、试剂和仪器Tryptone胰蛋白胨(广州市普博仪器有限公司),氯化钠(AR,天津市化学试剂一厂),琼脂(100g,广东省汕头市水产品综合加工厂),酵母浸膏(500g,广东环凯微生物科技有限公司),水合氯醛(AR,上海化学试剂采购供应五联化工厂),TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒,TIANGENPCR产物纯化试剂盒(由鼎国生物科技有限公司提供)。1.4实验中的细菌溶藻弧菌,由福建集美大学鄢庆批教授惠赠,由大黄鱼中分离。下文中编号为PCG011.5培养条件LB液体培养基:NaCl1g,蛋白胨1g,酵母膏0.5g,琼脂粉2g,溶于蒸馏水调pH至7.4并定容至100mL。LB血琼脂平板培养基:NaCl1g,蛋白胨1g,酵母膏0.5g,溶于蒸馏水调pH至7.4并定容至100mL,分装后121℃灭菌15min。待冷却至60℃左右以无菌操作加入脱纤维兔血,摇匀后立即倾注灭菌平皿内,待凝固后使用。TCBS培养基:酵母5.0g,蛋白胨10.0g,硫代硫酸钠10.0g,柠檬酸钠10.0g,牛胆盐8.0g,蔗糖20.0g,氯化钠10.0g,柠檬酸铁1.0g,溴麝香草酚蓝0.04g,麝香草酚蓝0.04g,琼脂14.0,pH8.6±0.2。取88g,加1L蒸馏水,加热至沸腾,后冷却至50℃左右分装入灭菌后的培养皿,凝固备用。邻硝基酚-ß-D-半乳糖苷试验培养基:邻硝基酚β-D-半乳糖昔(ONPG)60mg(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside),0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5)10mL,1%蛋白胨水(pH7.5)30mL。将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于10mm×75mm试管,每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。2结果2.1培养条件:体培养基的培养过程选取并剪出几种贝类(扇贝、牡蛎、贻贝各2只)及虾类(沙虾、虾蛄各4只)消化腺及腮部分,分别于研钵中研磨成糊状后分别加入装有30mLLB液体培养基的三角瓶中,以8层纱布封口,放入恒温培养箱37℃培养24h。培养24h后用接种环分别挑取上述少许培养液到装有LB血琼脂平板培养基的培养皿中划线接种,编号。倒板放置,36.5℃培养24h。从上述培养皿中挑出3~4个黄色3~5mm(直径)单个菌落,每单个菌落作一支斜面接种、编号,于35℃培养24h。革兰氏染色镜检,呈紫色的为革兰阳性菌,呈红色的为革兰阴性菌。然后选取革兰氏阴性反应的菌种进一步进行鉴定。2.2菌株的筛选及接种对要鉴定的新鲜菌苔用0.85%无菌生理盐水稀释至约109cfu/mL,用移液枪吸取0.05mL的菌液分别加入“070060弧菌科细菌生化鉴定盒”提供的各微量生化管内。将已接种的生化管套在无菌塑料帽,直立于三折吸塑短架内,于35~37℃培养箱中培养。结果有3株菌株与标准样的鉴定相似,如表1。从表1知虾类中未筛选到溶藻弧菌,编号1和3与标准样的溶藻弧菌的鉴别特征极为相似,而编号2中的少数几项数据有差异(赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶及8%,10%NaCl胨水),但是根据文献[7~9]及070060弧菌科细菌生化鉴定盒说明,溶藻弧菌与霍乱弧菌的生化反应特征相似,故不能肯定为溶藻弧菌,需要作进一步鉴定。霍乱弧菌可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(O-nitrophe-nyl-β-D-galactopyranoside,ONPG)而生成黄色的邻硝基酚,并且在短时间内呈现阳性,而溶藻弧菌呈现阴性,用此种方法进一步分离确定菌种。对表1的3种细菌用邻硝基酚-ß-D-半乳糖苷试验培养基进一步鉴定。以接种环挑取新鲜菌体接种于培养基,35℃培养18h。培养后编号3呈黄色的阳性反应,可鉴定为霍乱弧菌,1号和2号不变黄色,故可断定为溶藻弧菌。2.3hsp60基因分析HSP60基因序列是溶藻弧菌V.alginolyticus的特征基因,其已在GenBank中的登记,存取号为AY332570。若鉴定出有此基因序列,则可认定菌种为溶藻弧菌V.alginolyticus。根据文献HSP60基因保守序列设计上下游引物分别为P1:5’ACAACAGCAACGGTACTAGC3’,P2:5’CAACTTTCACGATGCCAC3’。PCR反应体系如下:8µLdNTPmix(1.25mmol/L),HSP60引物1和2(5pM)各10µL,1.25µLTaq酶(2U/µl),3µLDNA模板(50ng/µL~1µg/µL),加12.75µLddH2O至总体积50µL。HSP60基因PCR扩增条件为:94℃变性5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环;72℃延伸7min。1%的琼脂糖凝胶分析鉴定。对以上鉴定出的细菌进行PCR。将PCR产物按PCR产物纯化试剂盒说明书操作纯化PCR产物,测序。其总DNA的电泳结果见图1,HSP60RCR产物见图2。从图2的HSP60基因序列分析知,所测2株菌的序列用DNAStar软件分析后,其结果相同序列总长560bp,将所得序列Blast分析显示,2株菌的HSP60基因序列均与溶藻弧菌(V.alginolyticus)的HSP60基因序列的同源性最高,为99.8%。因此,该2株菌均为溶藻弧菌V.alginolyticus。2.4对溶藻弧菌和对网络中st和lt的检测目前人们对溶藻弧菌的研究大多集中在溶藻弧菌对海产生物的致病因子上,如蛋白酶、外膜蛋白以及内毒素脂多糖等[11~15];而对弧菌中可能存在的一些使人致病的因子如ST和LT的研究并不多见,也不深入。权太淑等报道从溶藻弧菌中检出与副溶血弧菌相同的耐热溶血素(ST),并发现有86.0%的菌株呈神奈川试验阳性,证实它的致病性与副溶血弧菌相似。林业杰等人对海产品中的部分致病溶藻弧菌的致病因子进行了检测,发现有3.3%和14.3%的菌株能够分别产生耐热性肠毒素(ST)和非耐热性肠毒素(LT);有82.9%的菌株能产生溶血素,但没有发现同时产生ST和LT毒素的菌株。因此有必要对溶藻弧菌的食物中毒因子进行深入的研究,探索不同溶藻使人致病的差异性的原因及机理。2.4.1培养条件观察结果以接种环挑取4株LB液体培养基内的新鲜菌液于血琼脂平板上划线接种,于恒温培养箱中37℃培养48h后观察结果。血琼脂平板培养结果显示,2株不同来源的溶藻弧菌中,只有1号溶藻弧菌具有溶血活性,而溶藻弧菌3号不具有溶血活性。2.4.2细菌培养液制备LT是蛋白质,在65℃30min即被破坏。LT在肠道可刺激小肠上皮细胞的腺苷环化酶,使ATP转变为cAMP,促进粘膜细胞的分泌亢进,产生大量肠液,引起腹泻。取从海产品中鉴定出的溶藻弧菌的新鲜培养液以3000r/min离心10min,取上清液经Φ0.22µm微孔滤膜无菌过滤。将禁食1d后的大白兔仰位固定于兔台上,耳静脉缓慢注入7%水合氯醛(按2~3mL/kgBW)4mL,麻醉后剖腹取出小肠,自回肠末端开始,结扎4~5节肠段,注射段4~5cm,间隔段2~3cm。向注射肠段注入细菌培养滤液1mL,关腹。18h后,再取出小肠,检查注射细菌滤液段肠内液体是否明显增多。2株溶藻弧菌产LT的检测结果显示出,注射溶藻弧菌1和2号的肠段积液都远远大于1mL,显然它们都具有很强的LT产生能力。2.4.3乳鼠肠道重量比和产st阳性确定ST分子量较小,无免疫原性,经100℃20min处理不被破坏,可以激活肠粘膜细胞上的鸟苷环化酶使胞内cGMP量增高,引起体液平衡紊乱而致腹泻。对家兔小肠作用较弱,维持时间仅6h左右。乳鼠是ST唯一敏感动物,故常用乳鼠灌胃法。取乳鼠编号,对照组2只经胃灌注入无菌营养肉汤培养基,其它分别灌入3种细菌滤液各0.1mL,禁食3~4h。解剖乳鼠,取出全部肠子,称量乳鼠肠子重量与摘除肠道后其余部分重量,求其重量比。实验结果如表2所示。根据文献[5~6],如果肠重/体重的比率大于0.09则为产ST阳性;如果比率在0.07~0.09之间,则产ST可疑;如果在0.07以下,则为ST阴性。从表2知,1和2号菌株的过滤液在注射后的乳鼠肠重/去肠体重比