家蚕滞育的生物学特性

家蚕滞育的生物学特性

这种停滞繁殖是指从一定阶段开始的生物生长和发育，然后进入不利生活环境的生理现象。滞育不同于休眠(dormancy),滞育过程中,即使适宜的温度到来也不会立即打破滞育而继续发育,相反,适宜的温度正适于维持滞育状态。昆虫滞育可以发生在任一发育阶段(卵、幼虫、蛹、成虫)。通过滞育,昆虫一方面使自己的生活周期与取食季节一致,以度过不良的生存条件;另一方面使种群发育齐一,以提高雌雄交配机会,保证种的繁衍。因此,滞育对于昆虫的生存、繁衍、进化发挥着重要的作用。滞育是由一系列阶段组成的动态过程,二化性家蚕滞育卵的发育可以被分为五个不同的阶段:滞育诱导、滞育决定、滞育起始、滞育维持、滞育终止。家蚕滞育发生在胚胎发育的原肠胚阶段,此时由于滞育卵缺乏控制细胞分裂由G2期向M期所需的细胞周期蛋白(cyclin)B,胚胎细胞停止在G2期而滞育。家蚕卵的滞育由母代蛹期脑-咽下神经节分泌的滞育激素(diapauseu3000hormone,DH)决定,而滞育的解除则需要一个较长期的低温或是人为地刺激,如HCL、H2O2处理等。以下即对近阶段家蚕卵滞育的生理生化机制、分子机制以及遗传机制的研究进展做进一步的详述。1高温、低温催青、非滞育卵的诱导家蚕滞育受遗传和环境的共同支配。家蚕二化性品系卵的滞育性是由亲代卵期(即亲代胚胎发育时期)所处的环境条件决定,高温(25℃)催青可以有效地诱导家蚕产滞育卵,而低温(15℃)催青则诱导家蚕产非滞育卵(图1)。1.1滞育卵中糖原和糖醇的转变家蚕卵滞育过程中由于环境和激素的刺激,核酸和碳水化合物的代谢以及糖原和山梨醇的利用都与家蚕滞育的诱导、决定、起始、维持、终止有关。在滞育的诱导阶段,海藻糖代谢转变为糖原,此时海藻糖酶为其限速酶;在滞育的起始阶段,糖原代谢转变为山梨醇,此时糖原磷酸化酶为其限速酶;在滞育的终止阶段,山梨醇代谢转变为糖原,此时山梨醇脱氢酶为其限速酶。滞育卵中这种糖原和糖醇的转变,一方面从能量代谢上讲,保存了氢分子,使之在滞育解除时再氧化制造ATP;另一方面从细胞生理学方面来看,糖醇是一种强力防冻剂,且对细胞膜有高度的透过性,不会对细胞造成伤害,因此积累的糖醇可以保护组织不受冬天低温的危害。1.2类胡萝卜素眼色素的测定在许多昆虫中,着色与滞育有密切的关系,而且着色可以作为辨别滞育和非滞育的依据。在黑色素、眼色素和类胡萝卜素等色素中,眼色素被认为是与胚胎滞育最密切的色素。浆膜中形成色素是滞育卵的特异现象之一,因此滞育卵着色,非滞育卵不着色。浆膜色素是眼色素系色素,是经过色氨酸→犬尿氨酸→3-羟犬尿氨酸代谢途径形成的(图2),滞育卵中由于浆膜色素的存在而呈深棕色,非滞育卵由于缺乏此色素而呈浅黄色或是白色。1.3谷胱甘肽向氧化状态的转变过氧化氢(H2O2)作为信号分子调控基因的表达、信号的转导和生理机能。另一方面,过氧化氢酶(CAT)负责H2O2的清除,可以将H2O2催化为H2O和O2。有研究表明,滞育卵产后24h用H2O2处理,可以阻止滞育的起始,并且浸酸处理和在5℃寒冷条件下解除卵的滞育都可以明显地观察到卵内H2O2含量的增加,这说明H2O2的变化与家蚕卵的滞育密切相关。在真核生物中,H2O2可以被过氧化酶或是一些氧化体系消除,而谷胱甘肽被认为是在氧化过程中消除氧化物所必需的。谷胱甘肽是细胞内主要的硫醇化合物,具有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形态。GSH/GSSG是细胞氧化胁迫的一个动态指示。在谷胱甘肽氧化循环过程中,经活性氧(ROS)的诱导,谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和硫氧还蛋白过氧化物酶(PrdX)催化GSH的氧化;而在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的诱导下,谷胱甘肽还原酶(GR)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)催化GSSG的还原。在滞育诱导的时期,卵内GSH/GSSG的比例降低,这是由于在诱导阶段与非滞育卵相比,滞育卵Prdx的活性较高,使得GSH强氧化为GSSG,导致了GSH/GSSG的比例较低,表明在滞育诱导阶段GSH和GSSG的反应趋于向氧化状态进行;在滞育的起始阶段,由于Prdx的活性较低,GSH的氧化减弱,使得GSH/GSSG的比例升高,表明在滞育起始阶段GSH和GSSG的反应趋于向还原状态进行;在滞育的决定阶段,GSH的强氧化和GSSG的弱还原导致了GSH/GSSG比例的降低,表明此阶段谷胱甘肽的转变向氧化状态进行,但是并没有发现PrdX活性的明显变化,这说明涉及到了其他的酶影响了GSH/GSSG的比例。实际上GR和TrxR的活性都降低,可能促进了GSSG的弱还原从而导致GSH/GSSG的比例降低;在滞育的终止阶段,滞育卵具有较低的GSH/GSSG比例,这是由于在PrdX催化下GSH的强氧化和GR催化下GSSG的弱还原导致。总之,在二化性家蚕品系中,谷胱甘肽向氧化状态转变与由滞育激素引起的滞育决定和5℃寒冷引起的滞育终止具有一致性。以上说明,谷胱甘肽的氧化循环与家蚕滞育的诱导、起始、决定、终止密切相关。1.4u3000ea4基因的转录表达时间间隔测定酶(Timeu3000intervalu3000measuringu3000enzyme-esteraseu3000A4,TIME-EA4)被称为家蚕滞育生物钟蛋白质。TIME-EA4起源于Cu-Zn超氧化物歧化酶家族,具有Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)活性和ATPase活性。其酯酶瞬时活性具有依赖低温和盐酸刺激等环境活化刺激因子的特性,通过空间结构的改变来打破家蚕的滞育。多肽抑制因子(peptidicu3000inhibitoryu3000needle,PIN)可以结合酯酶A4来阻止TIME-EA4的ATPase活性,停止酯酶A4阅读时间的功能。而低温、盐酸和温汤刺激处理可以使TIME-PIN分离,从而使酯酶A4的活性上升。EA4基因的转录水平在高温明催青和低温暗催青的家蚕卵中显著不同,但是其mRNA表达水平不会随着光照和温度的变化而变化,这说明EA4基因不是对滞育诱导条件做出应答的时钟控制基因。卵内EA4mRNA的转录在母代进行,产卵后,EA4mRNA的水平急剧下降,甚至在非滞育卵中消失。这表明EA4基因的转录在受精后被清除。并且EA4mRNA的表达水平在滞育卵和非滞育卵中一致。这说明基于TIME-EA4ATPase活性的滞育终止与EA4基因的表达无关,而是与TIME-EA4的蛋白结构有关。1.5br-sg中kbv的表达据有关研究报道,通过测定血淋巴和脑-咽下神经节(Br-SG)中儿茶酚胺(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺及其衍生物)的浓度,发现只有多巴胺的浓度在滞育类型幼虫和蛹的各组织中比非滞育类型高。通过人工喂食幼虫或向早期蛹注射多巴和多巴胺可以使非滞育类型转变为滞育类型,并且在自然滞育诱导条件下,多巴胺脱羧酶(DDC)转录水平增强,提高DDC活性,引起了Br-SG中多巴胺水平的增加,从而促进了滞育激素mRNA的表达,出现滞育类型。以上研究结果表明,血淋巴和Br-SG中多巴胺的浓度在滞育类型家蚕幼虫和蛹中要比非滞育类型高,Br-SG中多巴胺浓度的增加可以促进DH的产生,从而产生滞育类型。多巴胺与家蚕滞育有密切的关系。1.6u3000酸、碱和二甲酰胺的相互作用为了解除家蚕滞育,可以将滞育卵放置于5℃长达两个月,或是HCl处理来阻止或打破滞育,这种方法应用于养蚕业已近80年之久。虽然对HCl处理来打破滞育的原理提出了许多假设,例如HCl中的H+使蚕卵内、外的pH值发生改变,pH值可改变酶的空间结构,引起酶活性变化;一方面,pH影响酶活性部位催化基团的解离状态,使底物不能分解为产物;另一方面,pH值影响酶活性部位结合基团的解离状态,使之不能与底物结合;HCl处理可以刺激一些酯酶同工酶的活性和RNA的活性。但是关于其准确的机制至今还不清楚,还有待进一步研究。最近一项研究表明发现,二甲亚砜(dimethylu3000sulfoxide,DMSO)可以有效地阻止家蚕卵进入滞育。在二甲亚砜的最佳处理浓度(100%)下,滞育的阻止率近78%,这一效果可以与HCl处理解除滞育相当或接近。二甲亚砜在滞育卵产下后24h之内发挥作用,有效地处理时期要比HCl处理的时期短。二甲亚砜发挥作用阻止滞育在卵着色开始之前,滞育卵被眼色素(如眼黄素)着色开始意味着卵膜细胞上着色颗粒的开始形成,因此,二甲亚砜的有效处理时期是着色颗粒开始形成之前。相反,HCl处理来打破滞育在卵膜上眼黄素积累的着色颗粒形成之后。这表明,DMSO和HCl打破家蚕卵的滞育具有不同的分子机制,还有待进一步探究。2u3000家蚕卵繁殖的分子基础2.1u3000dh-pban蛋白表达控制昆虫滞育诱导和解除的内分泌系统大致可以分为3个类型(山下,1986)。第一种类型是由脑-前胸腺控制的蛹滞育;第二种类型是咽侧体控制的幼虫和成虫的滞育;第三种是咽下神经节控制的卵滞育。家蚕属于咽下神经节控制卵滞育类型,即咽下神经节(subpharyngealu3000ganglion,SG)分泌滞育激素(DH)控制其滞育。在家蚕中,滞育激素生物合成激活多肽基因(diapauseu3000hormone-pheromoneu3000biosynthesisactivatingu3000neuropeptideu3000gene,DH-PBAN)是一个神经多肽基因,它可以编码一个C末端包含五个氨基酸(Phe-X-Pro-Arg-Leuu3000NH2)的酰胺神经多肽(FXPRLa)前体,后此多聚多肽前体经蛋白水解酶的作用释放出DH(diapauseu3000hormone),PBAN(pheromone-biosynthesis-activatingu3000neuropeptide)andα-,β-andγ-SGNPs(subesophagealu3000ganglionu3000neuropeptides),其中DH应答于家蚕胚胎的滞育。滞育激素的靶器官是卵巢,对卵巢的作用过程为:血液将咽下神经节分泌的DH运送到卵巢;DH和存在于卵母细胞上的“DH受体”结合;这种结合作用于鸟苷酸环化酶,使之活性下降;鸟苷酸环化酶活性下降使cGMP合成受到抑制,结果cGMP浓度下降;cGMP浓度下降导致膜上海藻糖酶的活性提高,酶分解血液海藻糖成葡萄糖的反应加快,更多的葡萄糖通过膜进入卵母细胞,在卵母细胞中合成糖原。然而家蚕在胚胎期和幼虫期分别进行明催青和暗催青,滞育激素mRNA的表达在两者中并没有什么不同,这表明子代滞育卵的滞育是滞育激素的释放而不是滞育激素mRNA表达的结果,此激素的有无决定滞育诱导的开始与否。2.2对家蚕发育的影响众所周知,季节性非遗传多型性涉及到由环境条件(如光照,温度,湿度,营养等)决定的表型的可塑性。许多昆虫中都表现出了由于环境条件改变而自身身体或翅颜色以及结构而发生变化的现象。瞬时受体电位通道(Transientu3000receptoru3000potentialu3000channe,TRPu3000channe)是由存在于细胞膜上的一类重要阳离子通道构成的蛋白超家族,由Minke等人在研究果蝇视觉传导系统时首次发现。在哺乳动物中,已发现30种TRP通道亚型,分属于7个亚家族,即TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPA和TRPP、TRPN。TRP通道在脊椎动物和非脊椎动物有机体中对温度变化的感知都发挥了重要的作用。在昆虫中,TPRA1和其它TRPA亚成员可以调节昆虫对温度变化的感知。Sato等人在家蚕基因组中发现了13个TRP通道亚家族成员,并成功克隆了5个TRPA亚家族基因。通过BmTRPA1RNAi技术处理刚产下的滞育卵并在25℃暗处理条件下培养,结果发现注射了BmTRPA1dsRNA的卵高温(25℃)催青孵化后产下了部分非滞育卵,利用免疫组织化学技术检测BmTRPA1RNAi后咽下神经节分泌DH细胞的免疫荧光信号强度,结果发现与未进行的BmTRPA1RNAi的细胞相比其信号强度明显,表明BmTRPA1影响了蛹-成虫发育阶段DH的释放,从而影响家蚕子代滞育。以上结果说明家蚕胚胎期BmTRPA1作为一个热敏TRP通道在温度大于21℃时被激活,并且涉及到与DH释放相关的信号通路也被激活。为了探究BmTRPA1在卵内的分布位置,扫描电镜结果发现幼虫组织的发生和分化在胚胎发育的第20~23阶段后,利用抗BmTRPA1抗体进行免疫组织化学反应,发现BmTRPA1存在于各组织的非神经表皮细胞,因此BmTRPA1可能参与了其它生理过程的代谢调节。家蚕TRP通道可以被温度调节,探究发现利用Ca2+成像实验筛选到有些化学复合物,如福尔马林、H2O2、肉桂醛也可以激活BmTRPA1,从而影响子代滞育的诱导以及蛹重和茧壳重的增加,因此BmTRPA1可以作为控制家蚕季节性非遗传多样性从而来扩大家蚕业生产的靶标。因此,BmTRPA1充当了一个在具有季节性非遗传多型性有机体中控制可选择表型发育的分子开关,为家蚕滞育的研究提供了新的思路。3家蚕滞育的化性遗传家蚕滞育同时是一个极有魅力的遗传学课题,一直以来科学工作者对家蚕滞育的遗传学基础做了大量研究。化性(voltinism)是家蚕滞育遗传多型性的表现,即自然条件下一年内发生世代数多少的这一特性。通常可分为一化性(univoltine,V1)、二化性(bivoltine,V2或+V)和多化性(multivoltine,V3)。多化性为一年发生的世代数在3代及其以上者,又包括有滞育期多化性和无滞育期多化性。尽管化性是家蚕的一种遗传性状,但它同时又受温度、光照等环境因素的影响。这在家蚕的繁育上已经加以利用,即通过严格控制母体世代的环境条件来稳定品种的化性或适度调节后代的化性表型。外山(1906)和Mcu3000cracken(1908)早已提出化性属于母性遗传,即蚕卵受精后,卵继续发育直至孵化还是发育到一定阶段而进入滞育,虽然是F1代的性状,但在母代就已经决定。如果母代蛹的咽下神经节分泌滞育激素,那么子代为滞育卵;相反,子代为非滞育卵。因此,雌蛾所产下卵的化性决定于母体的基因型及母体世代所处的环境,而与交配雄蛾的基因型无关。化性的母性遗传是化性的基本遗传特征。梅谷(1925)最先发现了化性的伴性遗传。永友(1942)提出了伴性基因和常染色体等效越年基因的理论假说,合理解释了蚕的化性从一化到多化构成一个连续阶梯现象。诸星(1956)则以控制滞育激素分泌量的位于第6染色体上的化性主基因(显隐性为:V1>+V>V3)和位于Z染色体控制脑机能从而影响咽下神经节分泌机能的伴性成熟基因(显隐性为:Lm>+lm>Lme)来解释化性的伴性遗传现象。根据诸星的理论,家蚕的化性主要取决于由化性主效基因支配的咽下神经节分泌滞育激素的量,分泌量多则产滞育卵,分泌量少则产非滞育卵。同时咽下神经节分泌滞育激素的机能,在很大程度上又受到脑伴性成熟基因的影响,外界环境条件对蚕化性的影响就是通过调控脑伴性成熟基因而表现出来的。诸星的化性遗传理论得到了实验遗传学的支持和广泛的认同,一直为家蚕遗传育种和繁育研究提供了有力的指导。最终系统地揭示家蚕滞育的