详细介绍抗体的分离纯化精编版

2016.12.051抗体的制备、纯化及其应用

12/12/20162抗体的分离和纯化12/12/2016抗体的分离纯化3无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化。纯化：提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平。对治疗性抗体尤为重要。

12/9/20164一、样品处理分子类型产量特定的污染物来源：野生型人类血清多克隆的IgG，IgM，IgA，IgD，IgEIgG8-16mg/ml，IgM0.5-2mg/ml；IgA1-4mg/ml；IgD10-400mg/ml；IgE0.4mg/ml白蛋白，转运蛋白，a大球蛋白和其它血清蛋白杂交瘤细胞悬浮培养物单克隆多达1mg苯酚红，白蛋白，转运蛋白，牛IgG，a大球蛋白和其它血清蛋白，或者病毒无血清的杂交瘤细胞悬浮培养物单克隆1-4mg/ml白蛋白，转运蛋白，常常取决于培养基的情况腹水单克隆1-15mg/ml酯类，白蛋白，转运蛋白，脂蛋白，内源的IgG和其它的宿主蛋白蛋清IgY3-4mg/ml酯类，脂蛋白来源：重组表达胞外蛋白，表达到上清里面挂有表达标签的的抗体，抗体融合蛋白，Fab，或者其片段取决于表达系统宿主来源的蛋白，如大肠杆菌中的蛋白等，通常污染物较少胞内表达取决于表达系统来自宿主的蛋白，如大肠杆菌或者噬菌体等天然和重组型抗体主要污染物来源的总结

12/9/20165在样品纯化前要做的主要工作有：•除去某些杂质，如脂蛋白或者苯酚红等。•除去大量的杂志，如粗品中的含量大的杂蛋白等。•更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。

12/9/20166纯化前除去特定的杂质脂蛋白脂蛋白和其它含脂物质能够阻塞色谱层析柱，最好能在纯化前除去，腹水通常含有高浓度的脂蛋白。方法一：在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去。步骤如下：1．每毫升样品中加入0.04ml10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml1M的CaCl2；2．混合15分钟；3．10,000g离心10分钟；4．丢弃沉淀；5．使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中；注意：离心通常能够避免过滤时造成的蛋白非特异性吸附，血清蛋白样品可以通过玻璃绒毛过滤以除去酯类。

12/9/20167步骤如下:1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v);2.在4度搅拌4小时;

3.17,000g离心;

4.丢弃沉淀;5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;方法二:PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于pH4.0时沉淀。

12/9/20168苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去。苯酚红能够在pH>7时结合在阳离子柱上。苯酚红注意：使用脱盐柱除去苯酚红,并且把样品转移到合适的缓冲液中以做进一步纯化。

12/9/20169血清、腹水、细胞悬浮物或者细胞裂解物的净化离心或者过虑是实验室净化样品最常用到的手段，这些方法适用于任何来源的少量样品。注意：离心或者过虑后马上进行色谱层析纯化。离心用于除去大多数颗粒物质，如细胞碎片。如果在离心后样品仍然混浊，可以再选用一次5um的滤膜过滤，再用滤膜再次过滤。注意：对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000×g离心15分钟。对于细胞样品，可以在40000到50000×g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到15分钟。离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子。血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类。一、离心和过滤

12/9/201610过滤能除去颗粒物质。醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效的减少对蛋白的非特异性吸附。在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，这些列在下表中。滤膜通常的孔径大小色谱层析柱中柱材的颗粒大小1um90um或者更大0.45um30或者40um0.22um3，10，15um，或者需要更加干净的样品时采用选择滤孔大小注意：用一个预跑来检测目标蛋白的收率，因为有时候样品可能被滤膜表面非特异性吸附。过滤器可能会饱和——就是滤膜有一个特定的载量，因此在建立一个纯化步骤时，需要考虑这些。影响离心法的因素离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度（一）离心速度低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等。相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即：

12/9/20167（二）离心时间依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间；密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。8离心时间过长或过短，都会影响颗粒在离心管内的预期位置，降低分离效果。

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12/9/2016（三）温度为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形和失活，离心温度一般控制在4℃左右。离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以在室温条件下进行。超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统。13（四）pH离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。pH过高或过低都可能引起生物活性物质的变性、失活，还可能引起转子和离心机其它部件的腐蚀，应加以注意。

12/9/2016第二节沉淀分离14

如果样品中含有大量的低分子污染物,使用脱盐柱作为第一步色谱层析制备样品。增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。使用沉淀法去除大量的杂质低分子污染物一、盐析法在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。优点：①成本低，不需要昂贵的设备；②操作简便，安全；③对许多生物活性物质具有稳定作用；④对pH、温度要求不严格。缺点：分离效果有限

12/9/201615沉淀剂使用的典型条件样品类型备注硫酸铵下文有叔大于1mg/ml蛋白,特别使免疫球蛋白用于稳定的蛋白,不会变性,上清可以直接上到HIC（疏水层析柱）,减少了脂蛋白含量右旋硫糖苷加入0.04mlof10%右旋硫糖苷和1mlof1MCaCl2/ml混匀15min并10000×g离心可用于高脂蛋白的样品,例如腹水沉淀脂蛋白乙烯聚合物加入3%(w/v)后搅拌4小时,并17000×g离心可用于高脂蛋白的样品,例如腹水可以选择右旋硫糖苷PEG(Mr>4000)最多到20%血浆蛋白没有变性,上清可以直接过离子交换或亲和柱,完全除去比较困难丙酮(冷的)在0摄氏度最多到80%,在最高转速离心后收集小球可能会不可逆的使蛋白变性,适合于小肽的制备或者制备电泳样品聚乙烯亚胺0.1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫化精蛋白1%(w/v)沉淀聚集的核酸蛋白硫酸链霉素1%(w/v)沉淀核酸辛酸1:15(w/w)抗体含量应该大于1mg/ml沉淀血清或者腹水中的大量蛋白,仅把免疫球蛋白留在溶液中常用的沉淀剂

12/12/2016蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。16

（一）盐析的基本原理

12/12/2016常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2mol/L~3mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。17

（二）盐类和浓度的选择硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化的第一步。这个方法通常可以有效的除去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质。18饱和硫酸铵溶液:100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解;1MTrisHclpH8.0;

作为第一步纯化的缓冲液所需溶液:1.过滤(0.45um),或者10,000g4度离心;2.在10份样品中加入1份TrisHcl

pH8.0,以保持pH值;3.温和搅拌,逐滴加入硫酸铵溶液到50%饱和度,搅拌一小时;4.10,000g离心20分钟5.去除上清,用等体积的硫酸铵重悬洗涤沉淀两次(例如,不能够重悬蛋白或者进一步沉淀蛋白的溶液),再次离心;6.用少量下步中所用缓冲液重悬沉淀;

7.硫酸铵可以在superdex

G25中得到除去;*通过调整硫酸铵浓度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀杂质。⚠️离心后丢弃脂蛋白,样品可以通过玻璃绒毛以出去脂类。一些抗体可能被直接使用固体硫酸铵所破坏,硫酸铵沉淀应该尽可能的使用液体,在重悬时尽可能避免气泡的产生。⚠️在硫酸铵沉淀后,使用HIC作为后续步骤是最方便的。通常,可重复的纯化过程,应该避免使用硫酸铵沉淀,而选择用proteinG或proteinA

Sepharose柱子。通常,盐沉淀应该在蛋白浓度低于1mg/ml时进行。加入等体积的饱和溶液(甚至35%-40%),能够减少铁转移蛋白和白蛋白的污染。硫酸铵沉淀

12/12/2016（三）影响盐析的因素1.蛋白质的浓度过高过低都不好，一般认为2.5%~3.0%蛋白质浓度比较合适。2.pH蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大。盐析时溶液pH常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零。3.温度盐析一般对温度要求并不严格，可在室温下进行。但对温度敏感的物质，要求在0℃~4℃进行，防止蛋白质变性。4.离子强度离子强度越高，蛋白质溶解度越低，盐析也越易发生。不同蛋白质发生盐析所需要的离子强度不同19

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蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：透析法超滤法葡聚糖凝胶G50层析法。20

（四）脱盐

12/12/2016第三节离子交换层析法离子交换层析法（ionexchangechromatography，IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。21优点：①重现性好，简单易行；②分辨力强，回收率高；③具有多孔性，表面积大、交换容量大；④具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。

12/12/201622离子交换法的固定相是离子交换剂；若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。这些被固相单体所吸附的离子，统称为counterion（抗衡离子），因为其电荷与担体上的电荷相反(counter是"相反"的意思)

离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。一、 基本原理

12/12/2016阳离子交换反应：R-A-H++Y+—R-A-

Y+

+H+

阴离子交换反应：R-B+OH-+X-—R-B+X-+OH-

R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A-

和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，H+

和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，Y+

和X-分别代表溶液中的离子基团。23

12/12/201624离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管（1.5cm×15cm）中进行的。含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合。任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

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12/12/2016两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。

洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。26

12/12/2016三、技术要点（一）离子交换剂的选择和处理两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。（二）装柱和加样选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为20mmol/L~50mmol/LNaCl。27

12/12/201628（三）洗脱和收集洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。（四）离子交换剂的再生与保存使其带上所需的平衡离子。

12/12/2016四、影响交换容量的因素①离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及分离的样品组分的质量大小：一般离子交换剂的孔隙应尽量让样品组分进入，使样品组分与离子交换剂作用面积增大。充分暴露电荷基团增加有效交换容量；②离子强度：溶液中离子强度增大时，离子对交换剂上的束缚位点就会增强竞争作用，降低有效交换容量；③pH：弱酸型离子交换剂随着pH的增大，电荷基团解离增加，交换容量加大。但弱碱型离子交换剂的交换容量随着pH的下降而增大。带有强电荷基团的离子交换剂在任何pH的溶液中都处于解离状态，所以交换容量基本与pH变化无关。29

12/12/2016第四节凝胶层析（gelchromatography）

凝胶排阻层析（gelexclusionchromatography）

分子筛层析（molecularsievechromatography）是以各种多孔凝胶为固定相，当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，不需要有机溶剂、不改变样品生物学活性，除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外，还可以用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。30

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12/12/201632凝胶是一种不带电的具有三维空间的多空网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。一、基本原理

12/12/201633（1）蛋白质混合物上柱;（2）洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内，大分子则被排阻于颗粒之外;（3）小分子被滞留，大分子向下移动，大小分子开始分开;（4）大小分子完全分开;（5）大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。

12/12/201634如果两种以上不同相对分子质量的分子都能进入凝胶颗粒网孔，但由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此也可以分离开来。凝胶层析中物质的分子量不是唯一的分离依据，有些物质的分子量相同，但由于分子的形状不同，再加上各种物质与凝胶之间存在着非特异性的吸附作用，故仍然可分开。

12/12/2016二、常用凝胶凝胶是一类不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的化合物。常用的有：葡聚糖凝胶（dextran）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）琼脂糖凝胶（agarose）聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等。35

12/12/2016第五节亲和层析法亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团：一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变一个能与被亲和分子结合。36

12/12/201637亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子(B)杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与B具有专一性的分子(A,上图1)；A与B的专一性很高，只会在样本中与B结合，而排除其它杂质(上图2)；若把结合在吸着剂上的B溶离下来，就可以得到均质的B(上图3)。

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12/12/2016二、载体和配体的选择（一）载体理想的载体应具备以下特性：1.高度的亲水性，使固相配体易与水溶液中的生物大分子物质接近。2.惰性载体，非特异吸附性极低。3.具有相当量的化学基团可供活化，而且容易和配体结合，不改变载体和配体的基本性质。4.具有较好的理化稳定性，不易受到周围条件（如pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂等）的影响。机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速。5.具有均匀的多孔网状结构，能使被亲和的大分子自由通过而增加配体的有效浓度。常用的载体有纤维素、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。39

12/12/2016（二）配体优良的配体须具备以下特性：1.配体与待分离的物质有适当的亲和力。2.配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，不与其它组分有非特异性吸附作用。3.配体必须具备与载体共价结合的功能基团，而且这种结合不能严重影响配体间的亲合力及结合特异性。4.配体应具有较好的稳定性，能够耐受偶联以及洗脱时可能的较剧烈的条件，可以多次重复使用。40

12/12/201641亲和层析中部分蛋白配体配基纯化的物质蛋白A/蛋白G各种免疫球蛋白单克隆抗体各种抗原、蛋白A抗原特异性单克隆抗体、特异性多克隆抗体核苷酸核苷酸结合蛋白、核苷酸酶血凝素糖蛋白蛋白酶抑制剂蛋白酶脂肪酸脂肪酸结合蛋白、清蛋白糖血凝素、糖苷甘酶生物素亲和素、生物素结合蛋白肝素凝血因子、酯酶、DNA聚合酶、连接组织蛋白酶钙调蛋白钙调蛋白结合酶Triazine染料脱氢酶、激酶、多聚酶、干扰素、限止酶等

12/12/2016一种可应用的亲和纯化标签：6组氨酸标签组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合在低pH下用咪唑竞争洗脱42

12/12/201643抗体纯化填料选择要点一、填料种类的选择1）血清中的抗体含量

备注：ProteinA/G通常结合抗体的重链，而proteinL通常结合抗体的轻链。重链和轻链都有亚型之分，不同亚型对proteinA/G/L的结合能力不同。其中proteinL结合kappa链，不同物种血清总抗体中kappa链的比例不同。

12/12/2016442）proteinA/G/L的结合特异性BindingAffinitiesofrecombinantProteinL,ProteinA,andProteinGImmunoglobulinbindingdomains备注：上面这张表来自于pierce的说明书，给出了重要信息，对于不同抗体，ProteinA/G/L的结合能力不同。通常我们推荐首选proteinA填料，这种填料使用最广泛，有耐碱性的填料可以选择。只有当proteinA填料结合不好，才选择proteinG填料。

L不到最后要考虑。因为proteinL虽然在上表中看起来可以结合很多种类的抗体，其实它只结合kappa链，而kappa链本身还有进一步的亚型之分，所以对于单抗来说，不结合proteinL填料的概率是比较大的。

12/12/201645二、结合条件的优化1）proteinA的结合条件备注：亲和填料选定以后，需要考虑结合条件，洗脱条件的优化。只有经过优化，才能获得最高的纯度的同时保持抗体的活力,特别需要优化的是pH。相对而言proteinA对抗体的结合需要稍高一点的pH,具体选择见上表。

12/12/201646由proteinA/G对鼠抗igG1的亲和力表