苹毛丽金龟引诱剂的触角电位和嗅觉反应

苹毛丽金龟引诱剂的触角电位和嗅觉反应

苹毛利金龟（faldermann，1973）是一种非点源性昆虫。有几种寄主植物，但不同的寄主数量上存在很大差异。个别寄主植物表现出特殊的选择偏好（李子等，1973）。金龟甲在求偶、觅食、聚集等活动中常常借助化学气味物质传递信息,许多植食性金龟子的感觉细胞对绿叶挥发物及花的挥发物敏感(Renwick,1989)。以丽金龟科和花金龟科为例,取食和求偶都在花上,花的挥发物为其营养和繁殖提供必要的资源信息,因此可利用这些花的挥发物来诱集金龟子,进行预测预报和防治工作(Leal,1998;王广利和孙凡,2005)。研究表明,蒲公英花挥发物中的顺-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、苯甲酸苯酯可导致扁绿异丽金龟Anomalaoctiescostata的强烈趋向行为(Lealetal.,1994)。从玫瑰花中提取的诱集物对我国北方白星花潜金龟Potosiabrevitarsis(Lewis)和小青花金龟Oxycetoniajucunda(Faldermann)显示出了较强的诱集力(李仲秀等,1995)。花的挥发物香叶醇、丁子香酚、邻氨基苯甲酸甲酯和(Z)-3-己烯-1-醇对分布在欧洲大部分区域的植食性金龟子Phylloperthahorticola有诱集作用,其中雄虫对(Z)-3-己烯-1-醇的反应尤为强烈,黄色的诱捕器比灰色诱捕器能显著增加诱集数量(Ruther,2004)。丙酸苯乙酯、丁子香酚和香叶醇(3∶7∶3)的混合物对日本丽金龟的引诱最为有效,目前已被广泛应用于诱杀与监测(Leal,1998)。这些筛选出来的两性引诱剂成分,都是结构比较简单的天然化合物,由一些饱和的和不饱和的醛、醇和酯类物质构成,因此,这些物质可以看作是植物释放的利他素(kairomones),对金龟子取食、交配、产卵、栖息等行为起诱导作用(Visser,1986)。陈松笔等(2001)报道,采用日本金龟子诱剂组成物香叶醇、丁香酚和丙酸苯乙酯(3∶7∶3)以及日本金龟子性诱片组成的诱集物能够诱集到苹毛丽金龟成虫,单日最大诱集量达12头,但3种人工合成的单个植物挥发物对苹毛丽金龟诱集能力还不清楚。本研究选择了一些文献报道的金龟子诱剂化合物成分,这其中的一些化合物对多种金龟甲都有引诱作用,有些成分单独使用虽无引诱作用,但与其他化合物复合应用,能提高诱集能力(Imaietal.,1997;Rutheretal.,2001,2002,2004;Imraietal.,2002;Reineckeetal.,2002),测定这些化合物EAG和嗅觉反应,旨在为开发相关引诱剂奠定基础。1材料和方法1.1培养梨花的温度和光照供试苹毛丽金龟于成虫2009年4月8日采自秦皇岛市昌黎县城郊果园,置于温度25±0.5℃;光照L∶D=16∶8,人工气候箱中,用新鲜的梨树花喂养。2009年4月9-11日用于触角电位(electroantennograph,EAG)和嗅觉反应测试。1.2配成、贮藏化合物的编号、名称、纯度和来源见表1。用色谱纯正己烷(天津福晨化学试剂厂,下同)作溶剂,分别将每种化合物配成10μg/μL的溶液,贮藏于-20℃冰箱中备用。EAG测试时取各样品溶液浓度为1μg/μL,剂量反应测试时,将样品配成0.01,0.1,1和10μg/μL的溶液。1.3苹毛丽金龟的东南角位点研究在开始测定苹毛丽金龟触角EAG之前,作者进行了预备试验。如图1所示,将触角鳃片用昆虫针分离,将触角M1尖端切除(1/10)与不切除测得的EAG反应值无显著性差异。因此采用触角尖端不切除进行苹毛丽金龟触角点位研究,将会节省很多测试工作的工作量。实际测定的EAG值看,如果不用昆虫针分离触角鳃片,测得的反应值极弱,这是由于感受植物挥发物的嗅感器都分布在触角鳃叶内侧面,3片鳃叶不分离的情况下,阻碍了嗅感器无法与挥发物接触(路常宽和王晓勤,2009)。1.4活性物质的检测触角电位仪(Syntech公司)包括多用EAG探头、DAC-232双通道数据采集控制器、MP-15微动操作台、CS-55刺激气流控制器、双目实体显微镜、EAG2000记录分析软件等,连续气体流量为120mL/min,刺激气体流量为20mL/min。向玻璃电极内灌注0.9%NaCl电极液(Zhangetal.,1997),电极通过银-氯化银丝与SyntechUN-06交直流放大器连接,放大器信号输出端与微机相连,用Spike软件(Syntech公司)采集和分析数据。在解剖镜下用眼科剪将昆虫触角从基部剪断(图1),触角鳃片用昆虫针分离,首先将鞭节F(约1/2)插入玻璃电极中,然后调节微动旋钮,使得触角鳃片M1尖端(约1/5)插入另一端玻璃电极液内。在此操作过程中,在向玻璃电极吸入电极液时,注意防止产生气泡,而影响测试效果。11种植物挥发物EAG测定方法:取10μL待测试样品溶液滴加于滤纸条上(5mm×50mm),样品浓度为1μg/μL。立即将滤纸条塞进巴斯德管内,管口两端用Parafilm膜封上直至用于刺激(加样后1h以内)。同法取10μL色谱纯正己烷滴加于滤纸条上作为对照。测试时刺激时间0.1s,刺激气流体积2mL,两次间隔刺激大于1min。测试样品随机选取,并与溶剂对照交替测试,测定样品的EAG反应值与正己烷EAG的差值作为触角点位反应值(表2)。在剂量反应研究中,由于触角的EAG反应会随着测试时间的延长而逐渐降低,为了消除触角生理状态变化带来的影响,以100μg浓度为1μg/μL的顺-3-己烯-1-醇作为标准参照刺激,对各测试样品的刺激反应进行标准化校正。每次进行样品刺激前先进行1次对照(正己烷)和标准参照刺激,然后测试3个样品,再进行对照和标准参照刺激。将两次邻近的标准参照刺激的EAG平均值减去两次邻近的对照刺激的EAG平均值作为标准参照值,其他样品的EAG值减去对照的EAG平均值后再除以标准参照值进行标准化校正。1.5金龟子诱导物测试本部分研究仅对EAG测试中反应值较为明确(>0.4mV)的4种化合物(顺-3-己烯-1-醇、香叶醇、茴香脑和丁香酚)进行Y型嗅觉仪测定。Y型嗅觉仪由玻璃管制成,外径为6cm,主臂长为30cm,两测试臂长均为20cm,两者的夹角为45°。不同浓度刺激样品由正己烷配制而成,分别为0.1,1和10μg/μL。将10μL刺激样品滴加在滤纸条上,放入某一测试臂中,将含有相同体积正己烷的滤纸条放入另一测试臂中作为对照。此装置以气泵为动力,空气流经活性炭和蒸馏水被过滤与加湿后,每臂空气流量计调为300mL/min。由于周围光强不均匀影响金龟子的趋性行为,把嗅觉仪放在用白布和钢架制成的布帐(100cm×80cm×80cm)中,其内正上方放一个白炽灯(40W),尽量保持测试中光强一致。在实验过程中室温保持24±1℃。开启气泵,放入1头苹毛丽金龟,观察并记录其对测试臂和对照臂的选择情况。如果苹毛丽金龟5min内没有作出选择,则记为无反应。每个刺激样品测试20头成虫后,用蘸乙醇脱脂棉擦拭嗅觉仪内壁,蒸馏水冲洗,用电吹风吹干,同时更换新的滤纸条。每样品重复5次,每重复用虫20头。每种样品测定结束后,测定仪用乙醇擦拭、蒸馏水冲洗,放入180℃的烘箱内2h。同一种样品按照浓度由低到高的顺序进行测定,不同样品的测定顺序是随机的。反应百分率采用校正值,即反应虫数与对照反应数的差比上测试虫数。1.6计算机软件分析苹毛丽金龟的EAG反应值和行为测试结果的统计处理都采用Duncan氏新复极差法(LSR)比较检验差异显著性(P<0.05),统计分析软件为DPS3.01。2结果与分析2.1香叶醇、香叶醇、丁香酚和香脑嘴唇电位反应11种化合物中,全部对苹毛丽金龟雌雄触角产生触角电位反应,顺-3-己烯-1-醇、香叶醇、丁香酚和茴香脑触角电位反应值明确(表2),其他7种化合物反应值较弱。利用反应值明确的几种化合物进行剂量反应研究。如图2所示,在相同刺激剂量下,雌雄间EAG无显著性差异,EAG反应强度与化合物的剂量呈正相关。2.3率呈增长率通过Y型嗅觉仪研究发现,随着刺激剂量增加,雌雄校正反应百分率呈现增加趋势。但香叶醇100μg引起的嗅觉校正反应百分率都达到了70%以上,引诱效果较好,其他测试样品低剂量和高剂量无显著差异,说明增加剂量后,并没有引起引诱效果的显著增加。3顺-3-己烯-1-醇对苹毛丽金龟的行为诱导作用在本研究测试的11种化合物中,苯乙醇、苯乙醛、顺-2-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、反-2-己烯醛、顺-3-己烯乙酸酯、丙酸苯乙酯7种化合物对苹毛丽金龟雌雄触角EAG反应值较弱,而顺-3-己烯-1-醇、香叶醇、茴香脑、丁香酚4种化合物有明确的EAG反应值。采用Y型嗅觉仪测定表明,4种化合物雌雄间嗅觉反应百分率没有显著性差异。香叶醇1和10μg刺激剂量间校正反应百分率40%～54%之间,无显著性差异;丁香酚雌雄校正反应百分率在42%～60%之间,多重比较分析表明1,10,100μg剂量之间校正反应百分率差异不显著,说明较低剂量的丁香酚就能对苹毛丽金龟雌雄成虫产生引诱作用,这对将来野外组合引诱实验具有帮助。茴香脑1,10,100μg3个剂量校正反应百分率在45%～58%之间,雌雄虫间无差异,不同剂量间也没有差异;顺-3-己烯-1-醇3个剂量校正反应百分率在41%～57%之间,雌雄虫间无差异,不同剂量间也没有差异。以上4种化合物随着刺激剂量增加,反应值呈递增趋势。但香叶醇1和10μg刺激剂量与100μg刺激剂量校正反应百分率有显著性差异,而更高的刺激剂量(如1000μg)是否能显著提高校正反应百分率还有待于进一步研究。室内电生理实验和嗅觉测定都表明顺-3-己烯-1-醇对苹毛丽金龟具有活性,但还不清楚其行为学作用。Melolonthahippocastani,Melolonthamelolontha和Phylloperthahorticola3种金龟子利用顺-3-己烯-1-醇作为交配过程中定位寄主的线索(Reineckeetal.,2002;Rutheretal.,2002,Ruther,2004)。这一发现在鞘翅目几丁虫科害虫花曲柳窄几丁的研究上也有报道(deGrootetal.,2008)。在苹毛丽金龟扬飞的第二阶段,可通过取食植物叶片和花诱导产生该种化合物,但还不清楚刚刚羽化的雌成虫是否损害寄主植物释放顺-3-己烯-1-醇来引诱雄性成虫。从室内的嗅觉测定结果看,苹毛丽金龟雌雄对顺-3-己烯-1-醇引诱并无差异,如果象前述的3种金龟子一样,借助顺-3-己烯-1-醇定位寄主,近距离的雄虫定位雌虫可能需要依靠性信息。苹毛丽金龟雌雄成虫触角具有性二型现象,雄虫感受器数量是雄虫的1.8倍(路常宽和王晓勤,2009),这可能是雄虫保持寄主搜索和雌虫定位的进化证据之一。孙凡等(2006)研究发现,东北大黑鳃金龟雌雄成虫对反-2-己烯醛和5-甲基-1-己醇都能产生EAG反应,且对-5-甲基-1-己醇的反应强度略高于对反-2-己烯醛的反应强度;雌虫对这些气味的EAG灵敏度高于雄虫,而行为测试显示反-2-己烯醛对该成虫具有定向作用,5-甲基-1-己醇对成虫无显著的行为作用。从以上报道的文献看,金龟子利用植物挥发物定向的行为反应机制是较为复杂的。目前仅在鳃金龟和丽金龟科中发现雄虫对叶醇表现为更强的趋性,Hansson等(1999)证实了分异发丽金龟Phylloperthadiversa拥有调控绿叶挥发物的特化嗅感细胞,这表明这些化合物对该种金龟子行为调控具有重要作用。但Larsson等(2003)的研究认为一种非洲果实金龟子PachnodamarginataDrury对包括顺-3-己烯-1-醇在内的4种绿叶醇都没