酶工程动植物细胞培养产酶

关于酶工程动植物细胞培养产酶动植物细胞培养产酶概述动物细胞无细胞壁，容易贴壁对营养要求严格（血清培养基）对环境敏感（pH、溶氧、温度、剪切应力）植物细胞有细胞壁，但比微生物的细胞壁脆弱营养要求较动物细胞简单生长缓慢，培养周期长，要达到高密度较困难第2页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶概述植物细胞、动物细胞、微生物细胞培养的比较特征哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小(

m)10～10010～1001～10生长形式悬浮、贴壁悬浮悬浮营养要求很复杂很复杂简单倍增时间(h)15～10020～1200.5～5细胞分化有有限分化无环境影响非常敏感敏感一般产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度低低高供氧需求(KLa)1～2520～30100～1000产物种类疫苗、单抗、酶、生长因子、激素等天然色素、天然有机化合物等抗生素、有机小分子、酶等第3页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶概述植物细胞与动物细胞、微生物细胞培养的比较动物细胞、植物细胞和微生物细胞可以用相同方式培养动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长植物细胞和动物细胞对剪切力敏感植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同动物细胞——蛋白疫苗、抗体、激素、酶（蛋白质或多肽）植物细胞——色素、香精、天然药物（小分子）、酶第4页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶本章主要内容动植物细胞中酶生物合成的调节植物细胞培养产酶植物细胞及其培养特点植物细胞培养及产酶的工艺控制动物细胞培养产酶动物细胞及其培养特点动物细胞培养及产酶的工艺控制第5页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动植物细胞中酶生物合成的调节从基因到蛋白质有关微生物细胞中酶合成的调节理论也基本适用于动植物细胞动植物细胞具有比微生物更多的调节方式转录水平调节翻译水平调节激素水平、神经水平调节第6页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动植物细胞中酶生物合成的调节细胞分化改变酶的生物合成——端粒（telomere）端粒是真核生物染色体的末端结构由富含G、T的DNA简单重复序列不断重复而成人端粒序列：……TTAGGG……保护真核生物染色体免遭破坏牺牲自我，填补DNA复制后在5’-端留下的空隙端粒随细胞年龄的增长而逐渐缩短端粒酶（telomerase）——催化端粒合成和延长核糖核蛋白，其中的RNA部分含核苷酸模板序列，可构建端粒重复序列端粒酶一般存在于分化程度较低的细胞中第7页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动植物细胞中酶生物合成的调节基因扩增加速酶的合成通过增加基因的数量调节基因表达，可以发生在个体发育某一阶段或细胞分化某一过程细胞的一种应急方式基因扩增可以由选择压力

引起耐药性细胞的抗药性产生例：CHO细胞为对抗氨甲基喋呤对二氢叶酸还原酶的抑制，编码这种酶的基因急剧扩增第8页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动植物细胞中酶生物合成的调节增强子促进酶的生物合成增强子（modulator）——能高效增强或促进基因转录的一段DNA序列增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性，可高效增强某些酶基因的表达具有细胞或组织特异性，在不同细胞或组织中增强效果不同第9页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动植物细胞中酶生物合成的调节抗原诱导抗体酶的生物合成抗体酶（abzyme）：催化性抗体，是具有生物催化功能的抗体分子，是人工改造的对抗体可变区赋予催化特性的特殊抗体修饰法在抗体与抗原结合部位引进催化基团诱导法（主要方法）半抗原诱导酶蛋白诱导第10页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶1902年，Haberlandt首次提出分离植物单细胞并培养成植株的设想植物细胞的全能性Haberlandt第11页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶种类产酶植物细胞产酶品种胡萝卜细胞糖苷酶紫苜蓿细胞

-半乳糖苷酶甜菜细胞过氧化物酶、酸性/碱性转化酶、糖化酶大豆细胞过氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生细胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭细胞漆酶利马豆细胞

-葡萄糖苷酶番木瓜细胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜细胞超氧化物歧化酶菠萝细胞菠萝蛋白酶剑麻细胞剑麻蛋白酶第12页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞结构第13页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞的主要特点体积较大：比动物细胞和微生物细胞都大细胞生长速率和代谢速率低于微生物细胞，生长周期长营养要求较动物细胞简单细胞生长及合成次级代谢产物需要光照条件对剪切力较敏感主要用于产天然产物、色素、香精等有机物（次级代谢物）第14页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养的优势提高目标物的产率缩短生产周期木瓜蛋白酶：木瓜生长期8个月，木瓜细胞培养约1个月易于管理，不受自然因素控制可以提高产物质量通过严格的培养条件控制，减少植株病虫害和污染缺点培养条件要求高——光照、剪切力影响显著植物细胞生长缓慢——相对于微生物第15页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物体外培养胚培养、器官培养、愈伤组织培养、细胞培养第16页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养——外植体选择和处理外植体（explant）从植株取出，经预处理后用于组织和细胞培养的植物组织片段或小块根、茎、叶、芽、花、果实、种子等选择：无病虫害、生长旺盛、生长有规则切片：0.5～1cm消毒70%乙醇5%次氯酸钠/10%漂白粉0.01～0.1%HgCl2第17页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养——获取植物细胞：直接分离法直接分离法即直接从外植体中分离机械法将外植体捣碎，过滤或离心分离细胞质壁未分离；细胞破碎率高，完整细胞数量少酶解法利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体，分离具有代谢活性的细胞能降解细胞壁，必须对细胞给予渗透压保护第18页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养——获取植物细胞：愈伤组织诱导法愈伤组织（callus）由外植体组织增生的细胞产生的团状不定型的疏散排列的薄壁细胞群体本意是指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的可帮助伤口愈合的组织诱导过程配制半固体诱导培养基灭菌、植入外植体1～3周后继代培养第19页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养——获取植物细胞：原生质体再生法一般采用酶解法分离原生质体，使用纤维素酶和果胶酶混合物保持溶液的高渗

状态防止原生质体胀裂渗透压稳定剂：糖、盐、甘露醇、山梨醇等原生质体培养，再生细胞壁第20页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养——悬浮培养将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法悬浮培养的细胞一般来源于愈伤组织，选择较松散的为宜植物细胞培养——产物分离纯化收集培养液，从中获得所需的产物第21页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶植物细胞培养基水：一般用去离子水或蒸馏水无机成分大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co有机成分碳源：糖，以蔗糖

最常用氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys…）及蛋白水解物、无机氮维生素：主要是B族维生素和维生素C生长调节剂：生长激素、细胞分裂素等（微量）其他：肌醇、琼脂等第22页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶常用的植物细胞培养基MS培养基硝酸盐浓度较高，营养成分适宜，使用范围广B5

培养基NH4+

浓度较低，适用于双子叶木本植物White培养基无机盐浓度低，高Mg(II)、B(III)，适用于生根培养KM-8P培养基有机成分种类齐全，用于原生质体培养培养基配制配制母液，使用时按需要稀释第23页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制（掌握要点，与微生物对比）温度室温范围（25oC左右）最适产酶温度和最适生长温度不同pH微酸性（pH5～6）细胞培养时，pH一般变化不大溶解氧植物细胞需氧量不高，供氧不宜过量对剪切力敏感，通风搅拌不宜太剧烈第24页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶工艺条件及其控制光照光照对植物细胞的生长和产物合成具有重要影响（植物特色）光照有时也抑制产物合成添加前体前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质添加前体相对于添加了反应的底物刺激剂（elector）引导物质朝特定的代谢方向进行，强化次级代谢产物的生物合成常用微生物细胞壁碎片和胞外酶第25页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例——大蒜细胞培养产SOD超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）生物体内清除超氧化物阴离子自由基（O2·-）的重要金属酶类SOD和过氧化氢酶(catalase)、过氧化物酶(peroxidase，POD)一起构成了生物体内重要的酶促反应防御体系，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应第26页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例——大蒜细胞培养产SOD大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次在无菌条件下，切成0.5cm3

的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固体MS培养基中25oC，600lux，12h/d光照条件下培养18天，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次第27页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶植物细胞培养产酶产酶实例——大蒜细胞培养产SOD大蒜细胞悬浮培养将上述在半固体MS培养基上培养18天的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25oC，600lux，12h/d光照条件下振荡培养10～12天，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，25oC，600lux，12h/d光照条件下，振荡培养18天SOD分离纯化收集细胞，破碎，用pH7.8磷酸盐缓冲液提取第28页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶1907年，Harrison开创了动物组织培养的先河从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，放在青蛙的凝固的淋巴液中培养，蝌蚪的神经组织存活了数周，并且从神经细胞中长出了神经纤维1950s，Earle用动物细胞培养制取病毒疫苗1967年，动物细胞贴壁培养微载体开发1975年，杂交瘤技术动物细胞可产生较高价值的物质激素、疫苗、单克隆抗体、酶第29页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞结构第30页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞特性没有细胞壁，细胞脆弱（区别于植物和微生物）体积大，比微生物细胞大几千倍，但稍小于植物细胞在肌体内相互粘连，以群体形式存在在培养时具有群体效应、贴壁依赖性、接触抑制性、功能全能性营养要求复杂（血清培养基）第31页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的特点主要用于生产蛋白质生长缓慢容易受污染（细菌、支原体），培养过程中需添加抗生素对剪切力特别敏感（胞外缺少保护结构）大部分具有贴壁依赖性——贴壁培养培养基成分复杂，价格高昂细胞生命有限，一般最多继代培养50代即退化死亡第32页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式——悬浮培养适用于非贴壁依赖型细胞杂交瘤细胞、肿瘤细胞、体液（血液、淋巴液）细胞类似于微生物细胞的深层发酵，但工艺条件有较大差别对通气、搅拌耐受性差对氧气的要求较微生物低，培养时需通入一定比例CO2优点（相对于贴壁培养）细胞在培养液中均匀分散，生长情况良好传代培养容易，无需消化分散细胞培养基中营养成分利用率高第33页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式——贴壁培养适用于贴壁依赖型细胞上皮细胞、成纤维细胞细胞在培养容器表面迅速铺展并分裂滚瓶培养系统结构简单，但比表面积小微载体培养系统由葡聚糖凝胶等聚合物制得的微球兼具单层培养和悬浮培养的优势细胞生长环境均一第34页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养方式——固定化培养贴壁或非贴壁依赖型细胞均适用吸附法载体为多孔性颗粒，如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒贴壁型细胞的微载体培养即属此类包埋法将细胞包埋于琼脂、琼脂糖、胶原及血纤维等海绵状基质中细胞不易脱落固定化培养优点细胞损伤程度低，可重复使用产物分离容易第35页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养过程种质细胞体细胞（动物体内组织取出）杂交瘤细胞基本工艺过程第36页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养基氨基酸：必需氨基酸，如谷氨酰胺等，作为碳源和能源利用维生素：B族和维C，可由血清提供无机盐：调节渗透压微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供葡萄糖：作为碳源和能源（易产生乳酸）激素：胰岛素、生长激素、甾体激素等，可由血清提供生长因子：如表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，一般来源于血清培养基配制配制母液，使用前过滤除菌、稀释；Gln单独配制，冷冻保存第37页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制温度影响细胞生长，哺乳动物细胞：36.5±0.25oC影响CO2

溶解度，从而影响培养液pH

值渗透压保持细胞内外等渗状态，一般700～850kPa溶解氧供氧不足：细胞生长受抑制过量供氧：容易产生较多氧自由基，杀伤细胞用混合气代替空气（空气、O2、N2、CO2）第38页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制pH值与CO2

浓度动物细胞培养液pH在7.0～7.6之间，以pH7.4

为最佳最常用的缓冲体系为CO2/NaHCO3动物细胞培养时缺少CO2，培养液中的HCO3-

会被耗尽；CO2

保持了HCO3-

的浓度，以提供稳定的缓冲环境通常CO2

浓度维持在2～10%之间指示剂：酚红第39页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶动物细胞培养的工艺条件及其控制pH值——HEPES缓冲体系HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonicacidHEPESisazwitter-ionicorganicchemicalbufferingagent.HEPESiswidelyusedincellculture,largelybecauseitisbetteratmaintainingphysiologicalpHdespitechangesincarbondioxideconcentration(producedbycellularrespiration)whencomparedtobicarbonatebuffers,whicharealsocommonlyusedincellculture.HEPESislikewaterinthatitsdissociationdecreasesasthetemperaturedecreases.ThismakesHEPESamoreeffectivebufferingagentformaintainingenzyme structureandfunctionatlowtemperatures.第40页,共45页，2024年2月25日，星期天动物细胞培养产酶相关问题——为什么培养的细胞要及时传代传代培养：将原代培养的细胞分离、稀释并接种到新培养基上继续扩大培养的阶段体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长当细胞铺满培养器皿表面时，正常细胞停止生长，但是转化（即发生遗传物质突变）的、对接触抑制不敏感的细胞会继续生长如果不及时传代，这些转化的细胞就会逐步取代正常的细胞，导致正常细胞的退化动植物细胞培养产酶?第41页,共45页，2024年2月25日，星期天动植物细胞培养产酶动物细胞培养产酶产酶实例——人黑色素瘤细胞培养生产tPATissueplasminogenactivator(abbr.tPA)isaproteininvolvedinthebreakdownofbloodclots.Itisaserineprotease(EC3.4.21.68)foundonendothelialcells,thecellsthatlinethebloodvessels.Asanenzyme,itcatalyzestheconversionofplasminogentop