青霉素的生产工艺流程

关于青霉素的生产工艺流程知识目标：

掌握发酵生产青霉素的条件控制，及青霉素提取与精制的控制点。重点:掌握发酵生产青霉素的工艺流程难点:青霉素提取与精制的控制点第2页,共30页，2024年2月25日，星期天什么是青霉素青霉素又被称为青霉素G、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，能破坏细菌的细胞壁（革兰氏阳性菌）并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素是β-内酰胺类抗生素的典型代表。青霉素结构第3页,共30页，2024年2月25日，星期天青霉素的理化性质1、稳定性：固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大的关系；2、溶解度：青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其钾盐、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇；3、降解反应：青霉素是很不稳定的化合物，遇酸碱或加热易分解而失去活性，并发生分子重排。第4页,共30页，2024年2月25日，星期天（a）最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，不能满足工业生产要求，所以被淘汰。现在主要采用的的产黄青霉菌。（b）为了提高产黄青霉的青霉素产量使用的诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。菌种：第5页,共30页，2024年2月25日，星期天产黄青霉：Penicilliumchrosogenum深层培养菌丝形态菌落：平坦或皱褶，圆形。分生孢子：链状；颜色丝状菌球状菌黄孢子丝状菌绿孢子丝状菌：发酵单位85000U/mL绿孢子球状菌白孢子球状菌：发酵单位高，对原材料、设备要求高，提炼收率低。第6页,共30页，2024年2月25日，星期天第7页,共30页，2024年2月25日，星期天第8页,共30页，2024年2月25日，星期天青霉素发酵工艺1.发酵工艺流程第9页,共30页，2024年2月25日，星期天第10页,共30页，2024年2月25日，星期天孢子制备1、将沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化，得单菌落。2、再传斜面，培养7天，制得斜面孢子。3、再移植到优质小米或大米固体培养基上，25ºC，相对湿度45%-50%，生长7天，大米表面长出明显小菌落时要再振摇均匀，使菌丝在大米表面能均匀生长，制得绿色小米孢子。注意：①每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及检查杂菌情况。②斜面孢子和米孢子培养要注意湿度控制第11页,共30页，2024年2月25日，星期天种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油消沫剂等；接种量:>200亿孢子/t培养基空气流量:1：3（通气量与发酵液体积比）（m3/m3·min）；搅拌转速:300-350r/min；温度：27±1℃；时间:40h。质量：菌丝浓度达40%，菌丝形态正常第12页,共30页，2024年2月25日，星期天二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙，玉米油，消沫剂等；接种量：10％；空气流量：1:1-1.5（m3/m3·min）；搅拌转速：250-280r/min；pH：自然；温度：25±1℃；时间：10-14h；质量：菌丝浓度达40%，残糖1.0%以下，菌丝粗壮，III期（脂肪粒，积累贮藏物），无杂菌，效价在700u/ml左右。第13页,共30页，2024年2月25日，星期天生产罐培养工艺三级罐：生产罐；培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油,硅油.第14页,共30页，2024年2月25日，星期天培养基碳源青霉菌能利用多种糖，如：葡萄糖、乳糖。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。氮源可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。前体为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾（前少后多，氮源转为氨基酸）等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。第15页,共30页，2024年2月25日，星期天温度控制适宜菌丝生长温度一般为27ºC，分泌青霉素20℃20℃青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制26℃左右，后期降温控制22℃第16页,共30页，2024年2月25日，星期天pH控制合成适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：速度取决于pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖（补糖的控制可根据残糖量及发酵过程中的PH值或最好是根据排气中CO2及O2量来控制。一般在残糖降至0.6%左右，PH值上升时开始补糖。）、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）恒速补糖，用酸或碱控制方式

第17页,共30页，2024年2月25日，星期天溶氧控制＜30％饱和度，产率急剧下降；＜10％，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30％。通气比：1：0.8－1.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧第18页,共30页，2024年2月25日，星期天各阶段的供氧比较第19页,共30页，2024年2月25日，星期天消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌。前期:主间歇搅拌,少加油中期:搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时），策略：少量多次，一次过多影响呼吸代谢。后期:尽量少加消沫剂，可加水稀释第20页,共30页，2024年2月25日，星期天提炼工艺过程１．青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活２．水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定３．易溶于有机溶剂，水中溶解度很小４．青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性５．防止降解，条件温和、快速。第21页,共30页，2024年2月25日，星期天预处理青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：10－30Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白第22页,共30页，2024年2月25日，星期天过滤鼓式真空过滤机过滤：草酸或黄血盐一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%PPB（溴代十五烷吡啶），0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90％）第23页,共30页，2024年2月25日，星期天溶剂萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB(溴代十五烷吡啶)。萃取：2－3次。第24页,共30页，2024年2月25日，星期天逆流萃取过程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取2－3次，达到结晶要求。萃取条件：10℃下。萃取罐冷冻盐水冷却。第25页,共30页，2024年2月25日，星期天青霉素萃取方式多级逆流萃取

第26页,共30页，2024年2月25日，星期天脱色1.萃取液中添加活性炭，除去色素。2.过滤，除去活性炭。第27页,共30页，2024年2月25日，星期天结晶——直接结晶加醋酸钠－乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液：得到青霉素钾盐。薄膜蒸发工艺图第28页,共30页，2024年2月25日，星期天结晶——共沸蒸馏结晶萃取液，再用0.5MN