色层分离法生物分离工程

关于色层分离法生物分离工程色层技术（层析技术）色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。第2页,共97页，2024年2月25日，星期天色层分离方法－Chromatography

色层分离法是一组相关分离方法的总称，它的机理是多种多样的，但不管哪种方法都必须包括两个相。一相是固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离，或者说，易分配于固定相的物质移动速度慢，易分配于流动相中的物质移动速度快，因而得到逐步分离。第3页,共97页，2024年2月25日，星期天层析法的发展过程1903年

Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。1931年色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技术。1938年

Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法。1938年

Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同位素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱才得到广泛应用。1944年在美国橡树岭国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学完成了超铀元素的分离。第4页,共97页，2024年2月25日，星期天1941年Martin和Synge发展了分配色谱。1944年Martin等发展了纸色谱。1952年Martin和James发展了气-液分配色谱。1956年VanDeemter等发表关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色谱中。1957年制作离子交换色谱氨基酸分析仪。1959年在CordonConference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告。1963年Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。第5页,共97页，2024年2月25日，星期天60年代中期凝胶渗透色谱出现。60年代后期亲和色谱出现。1969年现代液相色谱开始受到重视。有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：1948年瑞典科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖，1952年英国的Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。第6页,共97页，2024年2月25日，星期天层析的原理“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。”

——马丁（A.J.P.Martin）（英）第7页,共97页，2024年2月25日，星期天

层析分离法常用的层析技术有(亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳）特点：（1）纯化倍数高（2）操作规模小，放大困难（3）

最终产品纯化（4）适用于价格昂贵的产品第8页,共97页，2024年2月25日，星期天层析分离分类（1）按溶质分子与固定相相互作用机理吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）凝胶过滤（分子大小与形状）实验技术分类低压（小于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)电泳(溶质在电场中移动）第9页,共97页，2024年2月25日，星期天⑴分析色谱（10mg）⑵半制备色谱(10-50mg)⑶制备色谱(0.1-1g)⑷工业生产规模色谱(>20g/d)年产10g合格的重组人粒细胞集落刺激因子（rhGcs-F），其产值高达1亿元。层析分离分类（3）第10页,共97页，2024年2月25日，星期天层析分离分类（3）根据固定相形状分类柱层析纸层析薄层层析根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析按操作方式分类（展开）迎头法（frontalanalysis)顶替法（displacementanalysis)洗脱分析（elutionanalysis)第11页,共97页，2024年2月25日，星期天基本概念（1）分配系数溶质在固定相与流动相浓度比值（2）解离常数有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与溶质在固相中的浓度比值（3）分离因素某一瞬间被吸附溶质量占总量的分数

(4)

阻滞因子分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动速度（距离）比值

(5)

洗脱（容积）溶出体积在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相体积

(6)

分辨率两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比

(7)理论塔板流动相与固定相平均浓度达传质平衡时的一段柱高（8）溶量因子固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比第12页,共97页，2024年2月25日，星期天色层分离法基本原理第13页,共97页，2024年2月25日，星期天色层分离法基本原理第14页,共97页，2024年2月25日，星期天分子筛层析示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>第15页,共97页，2024年2月25日，星期天分配系数在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律：

Kd=C1/C2Kd为分配系数C1，C2为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定低浓度第16页,共97页，2024年2月25日，星期天解离常数和分离因数）mt-结合溶质分子的有效位子总浓度m-空余的有效结合位子浓度q-溶质在固相的浓度c-溶质在液相的浓度解离常数第17页,共97页，2024年2月25日，星期天图3恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象第18页,共97页，2024年2月25日，星期天

Rf=

阻滞因数Am—流动相的平均截面积As---固定相的平均截面积流动相的移动距离＝V/Am第19页,共97页，2024年2月25日，星期天洗脱容积Ve在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积第20页,共97页，2024年2月25日，星期天第21页,共97页，2024年2月25日，星期天理论塔板fr—第r块塔板上溶质的质量分数为：r＝nE/(E+1)时rmax＝nE/(E+1)最大浓度塔板rmax＝nE/(E+1)E=第22页,共97页，2024年2月25日，星期天N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大第23页,共97页，2024年2月25日，星期天层析介质要求：（1）不溶于流动相（2）化学稳定（3）机械强度（4）大的表面积（5）粒度均匀层析介质种类无机（氧化铝，硅胶，活性碳）有机（琼脂糖，纤维素，聚丙烯酰胺等）第24页,共97页，2024年2月25日，星期天常用层析介质氧化铝：（活性氧化铝）它是一种多孔性、高分散度固体（1）有很大的比表面积，其微孔表面具有吸附性能。（2）分子式Al2O3简单，空间形态复杂，8种以上的形态（3）同一形态宏观结构性质如密度、孔隙率、孔径分布、比表面积等存在差异（4）吸附量与含水量关系很大制备：由氢氧化铝加热脱水得到的。吸附基团：铝离子种类：碱性：由氢氧化铝高温脱水，用于碱性稳定的溶质酸性：碱性氧化铝经盐酸洗涤，用于在酸性稳定的溶质中性：碱性氧化铝经水洗后活化制得应用：有机溶剂中分离天然成分第25页,共97页，2024年2月25日，星期天第26页,共97页，2024年2月25日，星期天硅胶硅胶是由多聚硅酸经分子间脱水而形成的一种多孔性物质（1）化学组成SiO2.XH20，（2）属于无定形结构，基本结构质点为Si—O四面体，相互堆积形成硅胶的骨架。质点间的空间即为硅胶的孔隙。（3）硅胶中的水以羟基的形式和硅原子相连而覆盖于硅胶表面。硅胶的分类（常以孔径大小来分），(1)特细孔硅胶(0.8nm以下)。

(2)细孔硅胶（1.5—2.0nm)(3)中孔硅胶(4.0一5.0nm)(4)粗孔硅胶(10.nm以上)应用：吸附层析剂与分配层析剂优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离，可用在水溶液中或有机溶剂中第27页,共97页，2024年2月25日，星期天琼脂糖由海洋生物琼脂提取得到的主要成分

①中性不带电②水溶性线状多糖③高亲水性，含大量羟基④能制成多孔性凝胶，分离大分子制备：

①去除带电琼胶成分②将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制得珠状介质。③采用交联剂增加介质的机械强度第28页,共97页，2024年2月25日，星期天

琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构a琼脂糖结构b亲水性凝胶结构第29页,共97页，2024年2月25日，星期天琼脂糖（2）介质商品种类Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B。经过交联而增加机械强度的琼脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B应用水溶液中分离蛋白质第30页,共97页，2024年2月25日，星期天葡聚糖α-1,6相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质：（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2）化学稳定性及热稳定性好（3）孔度与机械强度与交联度有关（4）用于凝胶过滤分子筛应用：水溶液中分离蛋白质等第31页,共97页，2024年2月25日，星期天纤维素β-1,4相连的D-葡萄糖（偶而有1，6键合）线性天然高聚物（1）亲水（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素（1）高孔度（2）高机械强度（3)亲水性强应用：离子交换分离蛋白质介质第32页,共97页，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺性质：（1）丙烯酰胺与交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺共聚（2）烷烃骨架与酰胺侧链（3）控制交联剂比例可控制网格孔度（4）亲水好，但不如多糖介质

(5)机械强度差应用：（1）凝胶过滤（2）电泳介质第33页,共97页，2024年2月25日，星期天亲和层析

亲和层析(AffinityChromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。生物体内相互作用的分子对：(1)酶—底物或抑制剂(2)抗原—抗体(3)激素—受体(4)糖蛋白与凝集素(5)生物素—生物素结合蛋白等第34页,共97页，2024年2月25日，星期天

基质活化方法与配基偶联活化(activation):

基质（matrix）上的化学基团是不活泼的,无法与配基直接偶联,通过化学反应使介质上化学基团处于活化状态。(1)大分子配基如蛋白质等可与活化基质直接偶联。(2)小分子配基,在基质与配基之间插入若干碳原子手臂(spacer),然后再与配基偶联。(3)环氧氯丙烷,1,4－丁二醇缩水甘油醚本身是活化剂亦具有手臂作用。第35页,共97页，2024年2月25日，星期天活化方法（1）A溴化氰法溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯到基质上、进而与配基偶联优点:（1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质（2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联（3）操作步骤简单,重现性好。（4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。缺点：（1）形成的异脲键易产生非特异性吸附；（2）共价键不稳定,配基容易脱落；（3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放。

第36页,共97页，2024年2月25日，星期天溴化氰活化与配基偶联化学反应式图6第37页,共97页，2024年2月25日，星期天

活化方法（2）B环氧氯丙烷活化

（1）所形成的共价键稳定,配基不易落脱（2）自动引入手臂,（3）有更小的非特异性吸附,（4）活化操作简单易行,危险性相对较小缺点：在强碱性条件反应，不适用于碱敏感物质。第38页,共97页，2024年2月25日，星期天环氧氯丙烷活化反应式第39页,共97页，2024年2月25日，星期天

环氧基的氨化及偶联配基反应第40页,共97页，2024年2月25日，星期天活化方法（3）C对甲苯磺酰氯活化（1）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。（2）配基与羟基间形成稳定化学键。（3）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在水相中进行。第41页,共97页，2024年2月25日，星期天对甲苯磺酰氯活化反应式第42页,共97页，2024年2月25日，星期天手臂（spacer)作用：减少亲和作用空间位阻连接：通过化学反应与活化基团连接手臂化合物：乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH环氧氯丙烷1、4－丁二醇缩水甘油醚第43页,共97页，2024年2月25日，星期天D残余电荷的掩蔽目的：防止产生非特异性吸附原理：通过化学反应消除基团上的电荷方法：（1）自发水解（2）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亚胺第44页,共97页，2024年2月25日，星期天手臂氨末端的掩蔽第45页,共97页，2024年2月25日，星期天残留羧基掩蔽反应第46页,共97页，2024年2月25日，星期天E活化基团与配基密度测定方法：（1）氨基或羧基可用酸碱滴定。（2）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法测定。（3）通过测定反应余液中配基残留量推算（偶联率较高的情况）（4）某些情况下需将亲和胶样品分解破坏测定第47页,共97页，2024年2月25日，星期天F亲和介质吸附容量测定

方法：（1）流出曲线法：

流出液中目标蛋白浓度达到进口浓度的90%（2）

Langmiur吸附等温线法第48页,共97页，2024年2月25日，星期天

层析装置与操作装置1

普通2高级柱操作（1）装柱：均匀，无气泡（2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH,盐浓度（3）上样(loading)：蛋白浓度，pH,盐浓度，缓冲液（4）洗涤(washing)：pH,盐浓度，洗涤剂，缓冲液（5）洗脱(elution)：条件与吸附相反（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿素，盐酸胍，硫氰酸盐（7）再生：与平衡条件相同第49页,共97页，2024年2月25日，星期天柱层析分离法的有关装置第50页,共97页，2024年2月25日，星期天PharmaciaÄKTA层析系统

第51页,共97页，2024年2月25日，星期天PharmaciaÄKTA层析系统

第52页,共97页，2024年2月25日，星期天装置⑴泵⑵混合器⑶层析柱⑷检测器⑸记录仪⑹分部收集器第53页,共97页，2024年2月25日，星期天装柱调糊：50%（缓冲液＋介质）一次连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降排除空气检查均匀度第54页,共97页，2024年2月25日，星期天上样样品处理：(1）溶解A调整浓度B盐CpH(2)过滤：除去不溶物流速：根据样品浓度与吸附速度而定上样量：80%吸附容量第55页,共97页，2024年2月25日，星期天淋洗（去除残留在介质中的杂质）盐浓度pH表面活性剂（0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质第56页,共97页，2024年2月25日，星期天洗脱方法按操作方式a恒定洗脱(isocraticelution)b分步洗脱(stageelution)c梯度洗脱(gradientelution)按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍洗脱体积：5倍床体积第57页,共97页，2024年2月25日，星期天恒定洗脱第58页,共97页，2024年2月25日，星期天分步洗脱第59页,共97页，2024年2月25日，星期天(c)梯度洗脱第60页,共97页，2024年2月25日，星期天清洗与再生弱酸：HAC碱：氨水促溶剂：1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M盐酸胍极性溶剂：20%乙醇表面活性剂：吐温-80缓冲液平衡第61页,共97页，2024年2月25日，星期天思考题1理解概念：解离常数，分离因素，阻滞因子，理论塔板高度，洗脱体积，分辨率。2不同的层析分类方法各有何意义？3常用的层析介质有哪些？各适用于何种状况下的分离？4亲和层析的机理是什么？5配基偶联后残留电荷对分离有何影响？如何消除？6小分子配基为何需插入手臂？7层析柱洗脱方式有几种？各适用于何种情况？第62页,共97页，2024年2月25日，星期天

第8章

色层分离法

（第二讲）

第63页,共97页，2024年2月25日，星期天柱层析分离法的有关装置第64页,共97页，2024年2月25日，星期天装置⑴泵⑵混合器⑶层析柱⑷检测器⑸记录仪⑹分部收集器第65页,共97页，2024年2月25日，星期天装柱调糊：50%（缓冲液＋介质）一次连续加入悬胶液打开出口阀：层析剂沉降排除空气检查均匀度第66页,共97页，2024年2月25日，星期天上样样品处理：(1）溶解A调整浓度B盐CpH(2)过滤：除去不溶物流速：根据样品浓度与吸附速度而定上样量：80%吸附容量第67页,共97页，2024年2月25日，星期天淋洗（去除残留在介质中的杂质）盐浓度pH表面活性剂（0.1-0.5%)淋洗体积：根据流出液杂蛋白浓度而定防止产物丢失又要除去杂质第68页,共97页，2024年2月25日，星期天洗脱方法按操作方式a恒定洗脱(isocraticelution)b分步洗脱(stageelution)c梯度洗脱(gradientelution)按洗脱机理专一性洗脱（specificelution）非专一性洗脱（nonspecificelution）添加剂：乙二醇,NaCNS、脲素、盐酸胍洗脱体积：5倍床体积第69页,共97页，2024年2月25日，星期天恒定洗脱第70页,共97页，2024年2月25日，星期天分步洗脱第71页,共97页，2024年2月25日，星期天(c)梯度洗脱第72页,共97页，2024年2月25日，星期天清洗与再生弱酸：HAC碱：氨水促溶剂：1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M盐酸胍极性溶剂：20%乙醇表面活性剂：吐温-80缓冲液平衡第73页,共97页，2024年2月25日，星期天无机吸附剂羟基磷灰石(hydroxyapatite、Ca10(PO4)6(OH)2（1）纯化蛋白质的无机介质。（2）廉价，易于大规模应用，（3）使用后易于清洁吸附机理与规律：偶极离子作用而不是离子交换作用(1)每一个正电荷区周围都有负电荷区，反之亦然。（2）蛋白质在中性pH范围具有最大的形成毗邻正负离子的可能性。◆电性作用是它吸附蛋白质的重要原因第74页,共97页，2024年2月25日，星期天羟基磷灰石(HydroxyIapatite，简称HAP)是一种结晶状无机盐，属六方晶系，存在于自然界中，与生物体有很好的相容性，也是目前分离各类生物分子最常用的液相色谱介质之一．在分离过程中，待分离分子以多种方式吸附于HAP晶体表面，即分子以不同的局部面向HAP晶体表面，并以不同方向排列．根据统计力学定律，在这些不同的吸附配置之间遵从Boltzmann分布，且能量最稳定状态配置的几率最高，酸性分子(pI＜7)主要吸附于c位点，碱性分子(pI>7)主要吸附于P位点．由于HAP晶面具有规则的立体化学结构，可以分辨被吸附分子表面上原子几何排列的微小差别．因此，HAP在DNA、核苷酸、多肽以及多种蛋白质的分离中得到广泛的应用第75页,共97页，2024年2月25日，星期天蛋白质在无机盐表面的偶极作用第76页,共97页，2024年2月25日，星期天工艺条件吸附：(1)pH在6—9之间吸附最有可能发生（2）低浓度缓冲液离子（通常是磷酸盐）（3）低盐浓度洗脱：（1）增加缓冲液浓度（2）高盐浓度中进行（3）盐可以采用恒定或梯度形式应用。第77页,共97页，2024年2月25日，星期天紫球藻B—藻红蛋白的分离纯化

紫球藻（Porphyridiumcruentum)的藻红蛋白粗提物经硫酸铵沉淀及透析后，分别用羟基磷灰石（HA）和SephadexG-100两种方法柱层析，均可分离纯化出B－藻红蛋白（B－PE），纯度（A545nm/A280nm)分别为4．92和3．78，两种方法纯化后的B－PE在聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳时均得到一条带，B－PE的最大吸收峰在545nm，其室温荧光发射峰为574．5nm。第78页,共97页，2024年2月25日，星期天藻红蛋白可作为荧光探针，用于免疫荧光检测、荧光显微、组织化学等方面。藻胆蛋白还是理想的天然色素，可应用于食品、化妆品工业研究发现从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白具有直接调节和激活免疫反应的生理活性。第79页,共97页，2024年2月25日，星期天吸附：1mmol／L,PH6.8磷酸缓冲液预平衡(1.8cm×4cm)层析柱上样量:2mL洗脱：磷酸盐缓冲液1、5、50、l00、200mmol／L，PH6.8，+0.1MOL/LNaCl溶液洗脱速度:18mL/h分步收集洗脱液(每管约4mL)紫球藻B—藻红蛋白的分离纯化

第80页,共97页，2024年2月25日，星期天B－藻红蛋白的洗脱曲线第81页,共97页，2024年2月25日，星期天体积排阻层析

SizeExclusionChromatography凝胶渗透层析

GelPermeationChromatography凝胶排阻层析

GelExclusionChromatography凝胶过滤

GelFiltration分子筛层析

GelChromatography22.9凝胶层析法第82页,共97页，2024年2月25日，星期天凝胶层析的用途

应用对象——主要是大分子物料，特别是蛋白质混合物。主要优点——相对成本低、操作简便，具有相对较大规模操作的能力。其它用途——脱盐，生物大分子按分子大小分级分离以及分子量测定等。第83页,共97页，2024年2月25日，星期天特性参数

排阻极限(exclusionlimit)分级范围(Fractionationrange)吸水量（waterregains）凝胶粒径(凝胶颗粒大小)床体积（bedvolume）空隙体积（voidvolume）第84页,共97页，2024年2月25日，星期天排阻极限不能进入到凝胶网络内部的最小分子的相对分子量，称为排阻极限。这时的洗脱体积就等于孔隙体积V0。譬如SephadaxG50的排阻极限是30kD。第85页,共97页，2024年2月25日，星期天分级范围能为凝胶阻滞、并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围。譬如：SephadaxG50的分级范围为1.5kD－30kD。第