神经元标记物

首页>实验材料和方法>神经元标记物神经元标记物PatimaTanapatPh.D.patimadottanapatatgmaildotcomPrinceton,NewJersey,UnitedStates译者王秀英博士maryatlabomedotcom美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司(SynatomResearch)DOI日期更新:2013-10-19;原始版:2013-06-05引用实验材料和方法2013;3:196简介神经元是大脑的基本信号组件。因此，一切尝试从整体上了解大脑是如何工作的基本组成部分都要从研究功能不同的各类型神经细胞开始。为此，免疫组化标记已逐渐成为神经科学家最有价值的工具之一。利用各种细胞组分的抗体，研究者能够识别表达神经细胞表型的细胞，而且，就其形态特征和特定蛋白表达收集信息。在下面的章节中，将讨论可以区分不同神经元细胞类型的方法。此外，由于能够将神经元和其他类型脑细胞区分开来非常重要，也会简要描述这些其他类型细胞。最后，免疫组织化学作为一种工具用于检验神经元群也会有讨论，重点介绍最常用的标记，以及在选择一个标记为一个特定的研究对象时一些关键的考虑因素。大脑的细胞神经元神经元由四个不同形态的部分构成：细胞体（躯干）、树突、轴突和突触前末梢。这些高度特化的细胞结构使它们能够传播电信号或动作电位，是神经元之间通信的基础。细胞体是细胞代谢的中心。它包含含有细胞DNA的细胞核和其他细胞器。从细胞体延伸出两种突起。第一种类型，称为树突，接收传入的信号，而第二种类型，轴突，输出传出的信号。通常情况下，神经元有多个树突。每个树突反过来又都可以包含成千上万的棘状突起，是从其他神经元的轴突输入信号的节点。（应该指出的是轴突也可能突触于胞体或轴突上，尽管这种现象并不常见。）轴突从细胞体上叫做轴突丘的区域延伸出来，负责动作电位的传播。它最终会分为几个分支，终止于突触。尽管突触被说成是神经元之间的接触点，但细胞之间并不互相接触，而是由称为突触间隙的结构分隔开来。在每个轴突分支的末端是突触前末端，其中包含充满神经递质的囊泡。当一个动作电位到达终端，囊泡的内容物被释放到突触间隙从而与突触后细胞的进行化学通讯。神经胶质细胞除了神经元，大脑也包含另一类称为神经胶质细胞的细胞。神经胶质细胞为神经​​元提供结构和代谢支持。它们大致可分为胶质细胞和小胶质细胞两大类。胶质细胞在生理条件下存在于发育和成年阶段。胶质细胞有四大类：星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞。星形胶质细胞支持和滋养脑细胞。它们保持了细胞外的离子平衡，为血管内皮细胞提供生化支持，并协助维持血-脑屏障。少突胶质细胞负责生成和长期维护，髓鞘能够隔离神经轴突和帮助动作电位的传播。室管膜细胞形成心室上皮层，包含脑脊液的空腔，以及脊髓中央管。它们也形成围绕脉络丛的上皮细胞层，脉络丛也产生脑脊液，作为血液和中枢神经系统之间的界面。放射状胶质细胞，其特点是有长的棘状突起，能协助新的神经细胞的迁移，在中枢神经系统的类型和区域特异性分化中发挥作用，并已被确定为生成神经元和神经胶质细胞的前体[1][2]。小胶质细胞最初来源于骨髓髓系祖细胞，在介导基于细胞的中枢神经系统的免疫功能中发挥了关键作用，包括细胞表面抗原呈现，通过分泌各种细胞因子促进炎症反应[3]。他们能通过吞噬清除杂质，以及分泌细胞因子改变疾病进展[4]。在发育过程中，小胶质细胞被认为在突触重塑、细胞凋亡、吞噬细胞清除和血管生成中发挥作用[5]。在成年后，小胶质细胞被发现参与调控细胞凋亡、突触消除、神经再生​​、神经监测以及病理条件下重塑中枢神经系统的管脉系统[5][6]。这些观察表明，小胶质细胞对于神经通路的成熟和塑造，以及这些通路调控下的神经活动是至关重要的。按照这个想法，也有人提出小胶质细胞的功能障碍可能是诱导精神和神经系统紊乱的一个原因[4]。大脑微管脉组织构成大脑微血管的内皮细胞也与我们讨论的非神经元细胞相关。伴随星形胶质细胞，这些细胞参与形成血-脑屏障（BBB）。血-脑屏障紧密调节离子、分子和细胞在血液和中枢神经系统之间运输，为适当的神经功能以及防止损伤和疾病提供所需的环境。血脑屏障的一个主要作用是防止血液中的有毒物质进入大脑。鉴定神经细胞的类型认识到神经家族存在巨大差异的第一个人，是神经生物学的奠基人SantiagoRamonyCajal。利用高尔基银染法，他观察到了单个神经元高度特异的形态特征。在这样做时，他发现，组成大脑的各种细胞在大小和形状上都有很大差异。而一些神经元如颗粒细胞从一个小胞体的产生呈现出相对简单的过程，其他如小脑浦肯野细胞则是非常绚丽的和复杂的。在Cajal的这一最初发现之后，科学家们已经能够分辨数百种不同的神经细胞类型。然而，仍然缺乏一个统一的分类系统。部分原因在于不同细胞的命名往往在描述精度上各不相同。此外，神经元的类别通常有相互重叠，其结果是，一个特定的细胞类型可以有几个不同的名字。不过，一般情况下神经元可根据一些标准，例如形态、突起模式、电生理特性和生化特性来进行分类。根据形态分类的实例（例如大小，胞体形状和树突状分支型态），可以说是在科学文献中发现的最常见的。虽然形态提供了一个明显的和易于使用的手段，其应用的更与次原理在于它的功能意义。由于一个神经元的形状是由它接收的输入信号和输出的目标共同决定的，神经元结构是细胞潜在联系的直接反映，因此也是其功能的直接反映。举个例子来说，攀登纤维的形状和小脑颗粒细胞轴突的分支。这里，轴突的形状是由连接浦肯野细胞树突的联系决定的，轴突分支同单一的树突存在大量的联系。同样，不同的形态所揭示的信息也可通过研究典型的锥体细胞来验证。椎体细胞的特点是一个大的、三角状细胞体加上各种不同的锥尖和基底树突。这种组织结构暗示其功能是将不同细胞层的输入信号整合为一个集成的消息并传达到另一个大脑区域[7]。用到的另一个重要的结构区分是基于一个神经元的轴突预测。那些从分离的神经群延伸出轴突从而连接的细胞成为突出或主要神经元，而只在核内有突触连接的细胞被成为中间神经元，或固有神经元。应该强调的是，这些术语是基于轴突突起，而不是根据输入信号的来源来命名的。因此，投射神经元可能只接收本地信号，相反固有神经元可接收从其他神经核传来的输入信号。鉴定这些形态的连接很重要，因为它提供了认识这些细胞功能的内在信息处理过程的基础。实际上，这一重要概念成为近年来整理大脑内神经联系网络图工作的基础，该网络图被称为的“连接组”。神经细胞类型也可通过其电生理特性得到区分。例如，新皮层神经元，其动作电位反应模式表现出显着的差异，通常为规则峰（RS），快峰（FS）以及大爆发（IB）的细胞。RS细胞在保持刺激上适应极强，FS细胞维持高激活频率与很少或根本没有适​​应，而IB细胞能单独或重复生成集群尖峰[8][9]。这些细胞放电模式的多样性是有意义的，它表明这些细胞对刺激的响应可被调节。关于迄今已有的区分标准，免疫组化可被用于提供关于细胞形态，以及在一定程度上提供的形态提供不同的神经元群的轴突突起的信息。然而，该方法在神经元表型分类上的真正能力在于它可以根据生化特性帮助区分细胞。事实上，这将在以下各节中所述，通过关联与一个特定的神经递质系统或一个特定的基因或蛋白质的表达来对神经元进行识别也是一个经常采用的策略。免疫组化用于鉴定神经细胞类型虽然高​​尔基染色法仍然是鉴定神经细胞类型一个有用的工具，但与之相关的技术仍有一定的弊端。其中最大的弊端是，即使实验成功了，染色结果也倾向于是可变的。虽然可以实现完全浸渍树突树，轴突分支和末端分支很难完全标记到[10]。此外，由于一些未知原因，浸渍作用仅能在1-10％的细胞中实现[11][12]。而这方面恰恰造成了Cajal的最初发现神经元在实际中是独立的这一发现，它使得很难针对特定的细胞，要满足样本大小要求，需要的组织的量也增加了。伴随着1970年代出现的免疫组化技术用于鉴定细胞类型，研究人员能够规避一些老方法，如高尔基染色相关的技术问题。到那个时候，研究人员已经开始使用免疫组化来确定神经元含有单胺合成酶酪氨酸羟化酶（TH），多巴胺β-羟化酶（DBH）以及色氨酸羟化酶（TRH）[13][14][14]。然而，在运用神经元特异性烯醇化酶（NSE）和非神经元特异性烯醇化酶（NNE）分别为神经元和神经胶质细胞特异标记的报道出来后，免疫组化用来鉴定细胞的技术才开始真正蓬勃发展起来[15]。紧随其后的是一些不同神经元类型中特异性表达的多种不同抗原标记，如NGF-介导的大外部糖蛋白（NILE-GF）[16]，胆碱乙酰基转移酶[17]，小白蛋白[18]，神经丝蛋白[19][20]作为了标记物。虽然这些并没有全部继续用于这方面的研究中，但方法学上的技术的影响仍然是重要的。通常，我们用到神经元抗原的分子性质和功能特性在发现它们的时候是未知的。然而，它们仍然有用的，因为它们能够在特定的神经元群中可靠表达。此外，采用免疫组化的优势也很显着。免疫组化技术上是非常容易实现的，组合免疫组化还能够用于检测与神经元标记共定位的多种其他功能的标记分子。最近，用于阐明神经元特性的分子生物学方法得到发展。利用转录调节子和位点特异性重组酶来标记特定的神经元群体的方法已经能够被研究者使用了[21]。然而，免疫组化仍是研究神经细胞类型的主要方法，因为它相对低的成本，只需要很少的专门设备，用到的试剂也是被广泛使用的。此外，常规显微方法可被用来搜集数据，并根据可视化方法，免疫标记组织可被保存以供将来参考。目前，研究人员在研究中有大量的免疫组化标记物来帮助区分大脑中细胞的表型。在以下部分中，将要讨论一些最常用的用来鉴定神经元和神经胶质细胞的标记物。图1.成年大鼠C6神经元用NSE（绿色）免疫标记，以及用DAPI（蓝色）复染图。比例尺=20µm.源自[72]图5A.神经细胞标记物神经元特异性烯醇化酶(NSE)NSE,也简称为γ-烯醇或烯醇化酶2，是由成熟神经元和神经元起源细胞持续表达的胞质蛋白（图1）。它是一种脑特异性的糖酵解酶，在细胞内能量代谢中起着重要的作用[22]。在发育过程中，NSE的水平非常低，但在神经元形态和功能成熟过程中增加[23]。虽然NSE作为神经元标记物得到广泛使用，但重要的是需要注意，它已被证明仅在特定条件下在神经胶质细胞中表达。具体来说，在培养的少突胶质细胞中检测到的NSE活性水平、蛋白和mRNA水平与培养的神经细胞相似[24]。少突胶质细胞分化过程中其表达增加，细胞成熟后受到抑制。在病理情况下，神经胶质肿瘤和反应性胶质细胞中也能检测到NSE[25]。神经核(NeuN)1992年，Mullen等人报道了能够识别脊椎动物神经元特异的核蛋白单克隆抗体的产生（图2）[26]。该蛋白被称为神经核（NeuN），能够在成年小鼠中枢和外周神经系统的多数神经细胞类型中检测到。NeuN的出现暂时与神经细胞退出细胞周期和/或终末分化开始一致。该蛋白质在胚胎和成年神经细胞中，除小脑浦肯野细胞、嗅球僧帽细胞、视网膜感光细胞、黑质中的多巴胺能神经元外的其他细胞中都能够检测到[27][28]。图2.小鼠大脑新皮层用NeuN标记的神经元的例子.源自[73]图3B.尽管NeuN的免疫组化检测已经被广泛使用，其功能知道最近才被了解清楚。研究人员现在已经能够将NeuN鉴定为Fox-3，Fox-3蛋白质参与调控的mRNA剪接[29]。由于Fox-3由神经系统特异性表达，人们发现它在调节神经细胞分化和神经系统发育中发挥作用[29]。微管相关蛋白2(MAP-2)MAP-2是一个神经元特异性的细胞骨架蛋白，能够作为神经细胞的表型的标记物[30]。它在脊椎动物胚胎和成年神经系统的组织中表达。在神经前体中表达较弱，但在随后显著提高（大约在神经元特异性微管蛋白亚型βIII一天后表达）[31]。在大鼠的研究已表明MAP-2至少包括2a、2b和2c三个亚型。MAP-2c似乎在早期发育过程中特异性表达，只在轴突中表达。MAP-2c在成熟过程中被MAP2a所替代。与此相反，MAP2b被发现整个生命过程中都有表达。MAP-2蛋白被认为参与微管组装，通过与中间纤丝和其他微管的交联作用稳定微管生长。具体来说，它可能在神经发育过程中决定和稳定树突形状中发挥作用，因此只有在树突轴心中能够观察到[32]。在一般情况下，它的表达似乎局限在神经元和反应性星形胶质细胞中[33]。ßIII微管蛋白(TuJ1)TuJ1是一种被认为参与神经元细胞类型特异性分化的微管蛋白[34]。微管蛋白是微管的主要结构，是细胞骨架的组成成分，在细胞结构的维护，有丝分裂，减数分裂，细胞内的运输等等方面发挥作用。因此，免疫组化染色发现TuJ1存在于未成熟的神经元胞体，树突，轴突和轴突末端。使用免疫组化检测TuJ1的显着优点之一是其展现轴突和末端细节的能力（图3）。事实上，已经发现它在检测细胞骨架元件受损后的变化中是有用的[35]。虽然某种β-微管蛋白的结构在胶质细胞中也有发现，但它却并不能被TuJ1抗体识别[35]。图3.标记细胞在成年小鼠齿状回区用双肾上腺皮质激素抗体标记的细胞。源自[74]图5.双肾上腺皮质激素(DCX)DCX在迁移神经元中广泛表达，在神经元发育早起也能观察到[36]。它是一种微管相关蛋白，在有丝分裂后的神经元表达，在细胞前缘的神经元突起生长中可能发挥作用[37]。与这一作用相关，DCX的免疫染色主要出现在神经突起的极端以及生长核的近侧区，而在尖端并不表达。临床上重要的神经细胞标记物值得注意的是，有一些神经细胞表型的标志物能够引起人们特别的兴趣，因为它们可用在了解临床疾病的病理上。其中两个是胆碱乙酰基转移酶和酪氨酸羟化酶。胆碱乙酰转移酶(ChAT)ChAT是催化乙酰胆碱合成的酶​​。因为它在绝大多数的胆碱能神经元中表达，ChAT的免疫反应性经常被用来作为在各种神经退行性疾病中认知能力下降的标志物。它的检测已经被用于研究阿尔茨海默氏病（AD）的典型神经性变化中，这是与基底前脑胆碱能神经元的大量损失相关的疾病。为了说明问题，验尸报告研究已经利用ChAT免疫组化揭示认知功能受损患者的高级额叶皮层和杏仁核的纤丝密度下降和轴突静脉瘤中[38][39]。此外，在动物模型中，免疫组化已被用于评价改变内侧隔核和布罗卡区域的ChAT阳性神经元数量的实验操作能力[40][41]。在扣带皮层、机动区和感觉皮质、基底前脑等区域，免疫标记也被用于评价ChAT纤维网的胆碱能神经元损坏和整体形态的变化[42][43]。酪氨酸羟化酶(TH)同样，酶TH免疫组化一直是研究帕金森氏病的一个重要工具，帕金森氏病是伴有黑质多巴胺能细胞损失的运动障碍疾病。TH能够限制多巴胺（以及肾上腺素和去甲肾上腺素）的合成速度。在验尸研究中，TH免疫组化已被用来量化帕金森氏症患者的多巴胺细胞损失[44]。为了研究这种类型的损失能否通过干预得到缓解，TH免疫组化已作为检测多种帕金森氏病的动物模型研究中保护作用的一种手段[45][46]。更多神经元标记物除了上述的标记物外，还有许多其他神经细胞相关的标记物也可以购买的到（表1）。标记物定位功能相关神经元唾液酸神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)细胞膜神经细胞粘附分子在调节细胞形态，发育过程中细胞生长迁移中发挥作用；被认为参与成年后激活的突触塑造[47]神经分化1(NeuroDorBeta2)细胞质和细胞核在脑中部分区域表达的转录因子；参与神经系统分化；是后生微神经正确分化所必需的，其缺失会导致细胞死亡[48]在不成熟的神经元中表达Tau轴突的远端部分，在树突中不存在*高度可溶的微管相关蛋白，相比非神经元细胞大多存在于神经元中[49];调节细胞骨架的稳定性，提供轴突的适应性[50]在中枢神经系统中丰富；在中枢神经系统的星形胶质细胞和少突细胞中也少量表达钙结合蛋白-D28k细胞体、树突和棘状突起；细胞质基质钙结合蛋白;在钙快速缓冲中发挥作用[51]浦肯野神经元，神经内分泌细胞中表达钙网膜蛋白细胞质基质29kDa的蛋白，与钙结合蛋白-D28存在58%同源性；在脊椎动物中枢神经系统中表达的第一个钙结合蛋白[52]广泛分布于不同的神经元群体，包括皮质中间神经元神经丝蛋白(NFP)轴突神经元细胞骨架蛋白；中间纤维；为轴突提供结构支持并调节轴突的直径[53];[22]广泛存在与不同的神经元群体；在一些神经元中含量相对较低表1.其他常用中枢神经系统免疫组化标记物。神经胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)毫无疑问，最广泛使用的星形胶质细胞的标记之一是GFAP（图4）。GFAP是一种中间丝在细胞中形成网络，为细胞提供支持和力量。GFAP被认为可控制它们的形状、运动和功能。在受伤的情况下（创伤或疾病），星形胶质细胞迅速增加GFAP表达[54]。最近，一些GFAP亚型已经确定[55]，包括GFAPδ，它在增生性放射状胶质细胞以及成年后的神经干细胞中表达[56]。图4.大鼠海马体中用GFAP标记的细胞比例尺=15µm.源自[75]图6D1.S100βS100β蛋白是一种由部分包围血管的成熟星形胶质细胞以及NG2-表达细胞表达的蛋白质，被认为是少突胶质细胞和星形胶质细胞的亚群的前体[57][58]。S100β参与许多不同的功能，包括突起延长，星形胶质细胞增生，轴突增殖，抑制微管组装[59][60]。此外，S100β蛋白已经被发现在发育过程中可作为神经营养因子，会在成年后的损伤中表达量升高[59]。波形蛋白中间丝波形蛋白是星形胶质细胞细胞骨架的组成部分。它也被放射状神经胶质细胞表达，在发育过程中起着重要的作用。更具体地说，它被认为通过磷酸化机制组织附着，迁移和细胞信号通路相关的关键蛋白[61]。在的损伤的条件下，波形蛋白参与胶质细胞的激活[62]，并与反应性星形胶质细胞迁移近端局灶性损伤的部位相关[63]。在一般情况下，波形蛋白已用作神经胶质细胞的可靠标记。然而，应该指出的是，也有报道其在发育期间和神经元损害的条件下也由表达[64]。2'，3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNPase)CNPase是一种在中枢和外周神经系统中高水平存在的酶。它几乎只存在于少突胶质细胞（和雪旺细胞）[65]，被认为对中枢神经系统的髓鞘形成很重要[66]。CNPase出现在少突胶质细胞发育早起，与许多其他髓鞘蛋白相比，能够成年动物的少突胶质细胞中持续表达[67]。膜结合的蛋白可以将微管蛋白连接到膜上，也可调节胞质微管的分布[68]。微血管标记物内皮屏障抗原(EBA)在一般情况下，形态特征能将微脉管内皮细胞分开。然而，微脉管系统的标记物EBA明确建立了对这些细胞鉴定的标记。与脉管系统其他标志物不同的是，EBA是正常的中枢神经系统微血管的免疫组织化学标志物，即它选择性地在神经系统中表达。蛋白质本身位于微血管内皮细胞的质膜中。在创伤性脑损伤以及表达由于血脑屏障破坏导致血浆蛋白漏出的情况下，EBA的表达量显着减少。目前，EBA在血-脑屏障功能中的作用尚不完全清楚。然而，研究表明，在大鼠中EBA免疫中和导致的血脑屏障破坏，表明了它在保持完整的血脑屏障中的重要性[69]。选择一个合适的免疫组化标记物适当的神经元标记物的选择取决于某一特定的研究目标。如果首要目标是建立一个神经细胞的表型，可用到如NEUN和MAP-2标记。对这些标记的抗体已被广泛使用，其标记特性和分布特征已经得到了很好的研究[70][31][26][29]。虽然这两个标记可用于需要评估神经元总数或神经元密度的研究中，但NeuN往往更倾向于是用于此目的的选择标记。这可能是由于其紧凑的核染色模式，相比分散的树突标记MAP-2，这可能更有利于足够量的数据的收集。此外，由于细胞计数的应用，由紧凑模式带来的高对比度（即信噪比）也是有帮助的。标记物蛋白序列号基因序列号文章数前三大供应商NSEP09104202611Dako(3),LifeTechnologiesCorporation(2),ThermoScientificPierceProducts(1)NeuNA6NFN31467138EMDMillipore(7),Dako(1)MAP2P11137413348Sigma-Aldrich(15),EMDMillipore(11),BDBiosciences(3)Tuj1ovance(4),EMDMillipore(1),Sigma-Aldrich(1)DCXO4360216416SantaCruzBiotechnology(5),EMDMillipore(1)GFAPako(35),Sigma-Aldrich(19),EMDMillipore(11)S100betaP04271628520Dako(10),LifeTechnologiesCorporation(2),Sigma-Aldrich(2)波形蛋白P08670743171Dako(23),Sigma-Aldrich(13),SantaCruzBiotechnology(4)CNPaseP0954312679Sigma-Aldrich(2),Abcam(1),ThermoScientificPierceProducts(1)表2.在10,113篇来邦网评估的文章中，用到神经元和神经胶质细胞的免疫组化标记物的文章数(num)。有时，一项研究可能涉及其他目标，需要满足额外的标记要求。例如，根据某一特定的神经递质对神经元作进一步区分时，神经递质受体或神经递质相关酶的抗体就可能被使用到。许多也是可用的，其中包括一些标记谷氨酸能的，GABA能的，胆碱能的或者血清胺神经元。在其他实例中，某一兼容免疫组织化学标记或其他方法的标记物可能是必要的。而这种情况在神经再生研究中经常出现，神经再生研究通常涉及联合标记细胞检测细胞增殖，如溴脱氧尿苷或氚标记胸苷，以及大脑区域的神经元标记。此外，根据细胞分裂的阶段，这些研究一般需要那种在细胞周期中某一特定时间段表达的标记。因为蛋白的表达依赖于细胞分化的阶段，标记的选择将显着影响需鉴定的新神经元数量。在新生细胞分化比例在组间变化的情况下，可能会用到一系列标记物来检测神经元在分化的不同阶段之间的差异。除了建立神经细胞的表型，免疫组织化学标志物可能也揭示了有关神经元的形态特征的信息。神经元特异性的抗体可用于揭示细胞结构。然而，标记是由靶蛋白在细胞内的分布决定的，在细胞核，胞体，树突和轴突中会有所不同。因此，可以获取的信息依赖于目标蛋白的定位。先前的研究报道了使用抗一种定位于整个树突树神经纤丝的抗体，该抗体进一步证实了树突状分支的变化[71]。这种方法有关的一个有趣发展是泛神经标记，其中包括了多种标记的组合，能够一次性的使神经元的整个细胞结构呈现出来。技术考虑用于免疫标记分析的显微镜的类型可能在一定程度上决定不同标记物的可行性。亮视野显微镜的优点是设置简单，对大多数研究者来说也很方便。此外，免疫标记在亮视野显微镜的组织处理是相对稳定的，在数据收集过程中不会淬灭。然而，亮视野显微镜相对于其他显微方法在分辨率方面存在不足，对同一平面而不仅仅是重叠的样品不能有效区分。因此，在使用这种方法时，共标记的标记物需要定位于细胞的不同区域才行。一般来说，免疫组化标记物建立共标记最好是用荧光显微镜来完成。除了允许在XY平面上共标记的鉴定为，这种类型的显微镜还能够生成连续的图像实现YZ平面上共标记唔的鉴定（图5）。荧光标记最显着的缺点是它不是永久标记的。长时间查看组织样品会导致荧光光漂白和褪色。同样，每通过一次共聚焦激光扫描都会导致漂白作用，因此相同的视野只能制造有限的扫描断面。幸运的是，用最新一代的荧光染料，这已变的不是问题了。事实上，一些与强荧光染料如Alexa-488和Alexa-555共轭的神经元标记物的抗体也能够获得了。[放大]图5.成年大鼠大脑中用巢蛋白（绿色）和βIII-微管蛋白（红色）双标记的细胞共聚焦图像。源自[76]图6A.另一个需要考虑的重要因素是实验组织保存和进行分析处理的方式。根据组织标本是否被石蜡包埋和用于保存的化学固定剂的不同的，某些抗体会产生更有效的标记。供应商有时会提供针对相同抗原的不同抗体，这些抗体在某一特定实验中的表现可能会大相径庭。此外，研究人员也可以采用一系列的策略提高信号的信噪比，包括使用血清阻断非特异性结合或利用过氧化氢淬灭内源过氧化物酶。组织固定中用福尔马林或其他醛会导致蛋白质交联，这样抗原位点被屏蔽，造成阴性或弱免疫标记。打破这些交联的抗原修复技术可以使用盐酸或甲酸，热，蛋白水解酶（蛋白酶K，胰蛋白酶，胃蛋白酶，链霉蛋白酶，蛋白酶），或去污剂（SDS，Triton-X）。虽然将上述因素考虑在内可以促进免疫标记实验的成功实施，但这并不能取代在给定研究条件下重新验证抗体特异性的需要。一种可能的策略是将免疫标记的数据与目标蛋白的mRNA原位杂交获​​得的数据进行比较。考虑到mRNA存在于细胞体内，但目标蛋白可能会定位于细胞其他地方，因此在这种方法中，验证的目标只能被限定为在同一细胞中对共标记的验证。除此之外，对一种蛋白质不同抗原决定簇的抗体标记也可以用来验证抗体的特异性。但是，证明特异性的最权威手段依然是在基因突变的动物模型中缺少标记，原本用于产生假定抗原的基因被敲除了（全局性或者组织特异性的方式均可）。多年来市售抗体的数量不断增加，研究者已经不再需要自己开发和验证抗体了。尽管如此，应该牢记的是抗体在高浓度或含有复杂的蛋白质混合物（如脑部分的特征）的条件下使用时，可能会与非靶抗原产生交叉反应。最终，无论抗体如何广泛使用特性多良好，对抗体进行验证的任务终将属于研究者本人。参考文献CampbellK,GotzM.Radialglia:multi-purposecellsforvertebratebraindevelopment.TrendsNeurosci.2002;25:235-8\o"NCBIpubmed11972958"PMID11972958SteindlerD.Neurogenicastrocytesandtheirglycoconjugates:notjust"glue"anymore.MethodsMolBiol.2012;814:9-22\o"NCBIpubmed22144297"PMID22144297CrossRefEglitisM,MezeyE.Hematopoieticcellsdifferentiateintobothmicrogliaandmacrogliainthebrainsofadultmice.ProcNatlAcadSciUSA.1997;94:4080-5\o"NCBIpubmed9108108"PMID9108108WakeH,MoorhouseA,MiyamotoA,NabekuraJ.Microglia:activelysurveyingandshapingneuronalcircuitstructureandfunction.TrendsNeurosci.2013;36:209-17\o"NCBIpubmed23260014"PMID23260014CrossRefEyoU,DaileyM.Microglia:keyelementsinneuraldevelopment,plasticity,andpathology.JNeuroimmunePharmacol.2013;8:494-509\o"NCBIpubmed23354784"PMID23354784CrossRefWoodleyD,ZelicksonA,BriggamanR,HamiltonT,WeissJ,EllisC,etal.Treatmentofphotoagedskinwithtopicaltretinoinincreasesepidermal-dermalanchoringfibrils.Apreliminaryreport.JAMA.1990;263:3057-9\o"NCBIpubmed2342217"PMID2342217MaslandR.Neuronalcelltypes.CurrBiol.2004;14:R497-500\o"NCBIpubmed15242626"PMID15242626MountcastleV,TalbotW,SakataH,HyvarinenJ.Corticalneuronalmechanismsinflutter-vibrationstudiedinunanesthetizedmonkeys.Neuronalperiodicityandfrequencydiscrimination.JNeurophysiol.1969;32:452-84\o"NCBIpubmed4977839"PMID4977839ConnorsB,GutnickM.Intrinsicfiringpatternsofdiverseneocorticalneurons.TrendsNeurosci.1990;13:99-104\o"NCBIpubmed1691879"PMID1691879LuoL.FlyMARCMandmouseMADM:geneticmethodsoflabelingandmanipulatingsingleneurons.BrainResRev.2007;55:220-7\o"NCBIpubmed17408568"PMID17408568ShimonoM,TsujiN.StudyoftheselectivityoftheimpregnationofneuronsbytheGolgimethod.JCompNeurol.1987;259:122-30\o"NCBIpubmed2438313"PMID2438313PasternakJ,WoolseyT.Onthe"selectivity"oftheGolgi-Coxmethod.JCompNeurol.1975;160:307-12\o"NCBIpubmed46234"PMID46234JohT,ShikimiT,PickelV,ReisD.Braintryptophanhydroxylase:purificationof,productionofantibodiesto,andcellularandultrastructurallocalizationinserotonergicneuronsofratmidbrain.ProcNatlAcadSciUSA.1975;72:3575-9\o"NCBIpubmed1059145"PMID1059145PickelV.Immunocytochemicallocalizationofneuronalantigens:tyrosinehydroxylase,substanceP,[Met5]-enkephalin.FedProc.1979;38:2374-80\o"NCBIpubmed39006"PMID39006SchmechelD,MarangosP,ZisA,BrightmanM,GoodwinF.Brainendolasesasspecificmarkersofneuronalandglialcells.Science.1978;199:313-5\o"NCBIpubmed339349"PMID339349SaltonS,Richter-LandsbergC,GreeneL,ShelanskiM.Nervegrowthfactor-induciblelargeexternal(NILE)glycoprotein:studiesofacentralandperipheralneuronalmarker.JNeurosci.1983;3:441-54\o"NCBIpubmed6338160"PMID6338160HouserC,CrawfordG,SalvaterraP,VaughnJ.Immunocytochemicallocalizationofcholineacetyltransferaseinratcerebralcortex:astudyofcholinergicneuronsandsynapses.JCompNeurol.1985;234:17-34\o"NCBIpubmed3980786"PMID3980786CelioM,HeizmannC.Calcium-bindingproteinparvalbuminasaneuronalmarker.Nature.1981;293:300-2\o"NCBIpubmed7278987"PMID7278987BoritA,BrooksT,OrdonezN,KakulasB.Centralneuralantigens:detectionanddiagnosticapplication.CritRevClinLabSci.1986;23:219-43\o"NCBIpubmed2426036"PMID2426036HayashiK,MotoiM,NoseS,HorieY,AkagiT,OgawaK,etal.Animmunohistochemicalstudyonthedistributionofglialfibrillaryacidicprotein,S-100protein,neuron-specificenolase,andneurofilamentinmedulloblastomas.ActaPatholJpn.1987;37:85-96\o"NCBIpubmed3107340"PMID3107340JefferisG,LivetJ.Sparseandcombinatorialneuronlabelling.CurrOpinNeurobiol.2012;22:101-10\o"NCBIpubmed22030345"PMID22030345CrossRefIwanagaT,TakahashiY,FujitaT.Immunohistochemistryofneuron-specificandglia-specificproteins.ArchHistolCytol.1989;52:13-24\o"NCBIpubmed2510778"PMID2510778MarangosP,SchmechelD,ParmaA,GoodwinF.Developmentalproneuron-specific(NSE)andnon-neuronal(NNE)enolase.BrainRes.1980;190:185-93\o"NCBIpubmed6769532"PMID6769532SensenbrennerM,LucasM,DeloulmeJ.Expressionoftwoneuronalmarkers,growth-associatedprotein43andneuron-specificenolase,inratglialcells.JMolMed(Berl).1997;75:653-63\o"NCBIpubmed9351704"PMID9351704VinoresS,MarangosP,BonninJ,RubinsteinL.Immunoradiometricandimmunohistochemicaldemonstrationofneuron-specificenolaseinexperimentalratgliomas.CancerRes.1984;44:2595-9\o"NCBIpubmed6722796"PMID6722796MullenR,BuckC,SmithA.NeuN,aneuronalspecificnuclearproteininvertebrates.Development.1992;116:201-11\o"NCBIpubmed1483388"PMID1483388CannonJ,GreenamyreJ.NeuNisnotareliablemarkerofdopamineneuronsinratsubstantianigra.NeurosciLett.2009;464:14-7\o"NCBIpubmed19682546"PMID19682546CrossRefKumarS,Buc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