表观遗传学染色质结构的分子水平研究00课件

17四月2024表观遗传学染色质结构的分子水平研究00Anyquestion?Contactmeat:BBS:楚布衣(丁香园)Email:buyi.chu@(Googletalk)QQ：2308659Tel:757475DepartmentofMedicalGenetics多色FISH

（24种染色）染色体病？染色体结构？DepartmentofMedicalGeneticsT(9:22)相互易位导致慢性粒细胞白血病Whatisepigenetics：theDifferentphenotypecausedbydifferentgenomedecodingindifferentenvironments.Howisepigenetics:environmentisthekey.

chromatinisthemostimportantenvironmentofDNA表观遗传DNA甲基化组蛋白修饰和组蛋白密码染色质重塑非编码RNA调控TherolesofchromatinstructureinepigeneticsandtranscriptionEpigeneticschromatinTranscriptionHistonevariantsChromatinremodelingNon-codingRNADNAmethylationHistonemodificationsChromatintrans-actingfactorsRoeder,2010ThemolecularmechanismofepigeneticsChromatin:anepigeneticplatformEpigeneticmechanisms:

.DNAmethylation.Histonemodifications.Chromatinremodeling.Histonevariants.RNAi.DNA/RNAeditingAllis,JenuweinandReinberg,Epigenetics2006储存信息组织信息表达信息先有细胞，还是先有DNA？谁因谁果？自然环境和人相互影响；基因组环境与基因组也是相互影响的。道法自然，天人合一。基因组DNA和其所处环境的鸡和蛋问题：“thecausalinteractionsbetweengenesandtheirproducts,whichbringthephenotypeintobeing”ConradHalWaddington

(1905–1975)ConradHalWaddington:thelastRenaissancebiologist?NatureReviewsGenetics3,889-895,2002Epigenetics基因的产物形成环境来影响基因！！哈佛大学遗传学教授乔治·切奇代孕母亲的不同，对后代的影响？一、染色质结构与核小体二、染色质重塑三、方法与应用不同生物的遗传信息（基因）表达特点病毒：时间依赖性调节和利用宿主细胞的机制；细菌：组成性表达+负反馈调控；真核生物：以核小体为基本单位的染色质，以激活和沉默为基本方式调控基因的表达。DNA序列缠绕在核心组蛋白的八聚体上DNA所处环境：核小体染色质:阴阳理论常染色质异染色质-较为疏松-基因密度高基因活化在S早期复制DNA缺甲基化-组蛋白H1缺乏组蛋白具有活化性质的修饰-高度致密-基因密度低基因沉默在S后期复制DNA过甲基化-组蛋白H1密集组蛋白具有抑制性的修饰异染色质与常染色质常染色质组成型的异染色质端粒动粒染色体上基因沉默的区域染色体上基因活化的区域组蛋白与DNA的结合1.保护遗传信息；2.控制遗传信息的表达。给定一段DNA序列，其和组蛋白组装成核小体时，有无规律？哪些区域结合组蛋白？核小体的分布A：有丝分裂间期的染色体纤维：30nmB：DNA链拉伸后核小体的分布核小体1.链上的珠子+连接DNA:~200bp2.核心组蛋白；3.通过核酶切割DNA：直径11nm的核小体核小体(2)1.核心组蛋白：8个组蛋白的复合物；2.146bp的核心DNA；3.平均缠绕1.65圈。核心组蛋白A.核心组蛋白：H2A,H2B,H3&H4B.组蛋白的结构；C.组蛋白二聚体的结构核心组蛋白(2)二聚体：H3&H4,H2A&H2B核心组蛋白(3)四聚体vs.八聚体核小体DNA序列缠绕在核心组蛋白的八聚体上核小体核小体呈致密或疏松状态，形成30nm的染色体纤维组蛋白H1确定核小体的边界核小体的分布1.8~114bp的连接序列；2.序列特异性的DNA结合蛋白质结合裸露的DNA序列。DNaseIDNaseI与DNA双螺旋的小沟结合，并切断磷脂键；DNaseFootprinting当有组蛋白与DNA结合之后，可观察到不能被切割的部分Naked&nucleosomalDNATranscriptionfactorfootprintDNA组装到核小体上能够阻止DNaseI的切割DNaseI切割：平均间隔~10bpQuesion1：组蛋白和DNA序列的结合有无规律？

Answer：StructureofNucleosome核心组蛋白H1组蛋白其他组蛋白核心组蛋白H1组蛋白核心组蛋白Question2：Howistheinteractionbetweenhistone&DNAOK,每146bpDNA和组蛋白包裹形成核小体。对一给定DNA片段，从哪里开始包裹组蛋白？基因组上的一段DNA是随机的分布在核小体的任何位置？还是特定位置？核小体定位：NucleosomepositioningRandom？核小体定位：NucleosomepositioningRegulated？InvivoResults：定位不是随机的，存在内在定位机制优先装配的核小体内在定位机制：定位信号（AA,AAA，（CA）n，（GC）n外在定位机制：在优先核小体装配后，以确定长度特性重复出现G∶CcontentisanessentialdeterminantSection2：

HistoneModification组蛋白与核小体Histonevariants组蛋白修饰组蛋白修饰(2)主要的功能基团AcetylMethylPhosphorylUbiquitin组蛋白修饰的功能基因转录、DNA损伤修复、DNA复制、染色体凝聚等修饰类型一、组蛋白的乙酰化二、组蛋白的甲基化三、组蛋白的磷酸化四、组蛋白的泛素化五、组蛋白的SUMO化六、组蛋白密码Section3、Chromatinremodeling染色质重塑ChromatinRemodeling：遗传信息表达、复制和重组过程中，染色质的包装状态，核小体中的组蛋白以及对应的DNA分子会发生改变的一种现象。组蛋白的乙酰转移酶的结合活化相应区域去凝聚状态的染色质活性染色质的产生组蛋白乙酰化酶染色质重塑复合物组蛋白去乙酰化酶染色质重塑复合物1.两类酶调控染色质重塑的过程：组蛋白修饰因子(histonemodifiers)以及ATP依赖的染色质重塑因子(chromatinremodelers)2.histonemodifiers并不改变核小体的位置，而是在组蛋白上作标记，以招募其他的活性成分(组蛋白密码)3.chromatinremodelers：水解ATP释放能量，从而改变染色质的结构染色体重塑的当前认识：染色质重塑因子核小体染色质重塑因子与核小体的相互作用细胞中存在着各种不同的染色质重塑因子复合物：激活或者沉默基因的表达染色质重塑因子(Chromatinremodelingfactors)，ATPase,按照蛋白质功能结构域的组成分类：SWI2/SNF2ATPaseSUPERFAMILYSWI2/SNF2subfamilyISWIsubfamilyCHD/Mi2subfamilyIno80subfamilyATPaseBROMOATPaseSANTATPaseDNAbindingCHROMOATPaseATPaseSANTSWI3ADA2N-CoRTFIIIBBROMOfromDrosophila:BrahmaSWI/SNFSWI/SNF复合物中的功能结构域RecognizesacetylatedlysinesinhistonetailsBindsDNA(sequencedependantORindependent)BindsDNA(sequencedependantORindependent)BindsDNAANDproteinBindsDNAandmaybealsohistonetailsdunnowhat’sthisdoinginthenucleus???ISWI复合物ChromatinaccessibilitycomplexNucleosomeRemodelingFactorATP-dependentchromatinassemblyandremodelingfactorNucleolarremodelingcomplex

异染色质的复制rDNA的抑制同源异型基因的转录有丝分裂期间保证姐妹染色体之间的连接ISWI复合物ISWI分离间期在核内的定位ISWI与RNAPolII几乎不重叠ISWI可能与染色质的沉默有关Deuringetal.(2000)Mol.Cell5:355总结:SWI/SNF&ISWI1.主要的两类ATPases并构成大的复合物，形成染色质重塑复合物2.利用ATP的能量将核小体DNA重塑3.SWI/SNF亚家族的成员通常与活化的染色质相关联，也可以与沉默的相关4.ISWI亚家族与沉默的染色质相关，也可以起活化功能5.染色质重塑因子vs.染色质修饰因子关键：染色质重塑因子定位到核小体甲基化介导:SWI/SNF通过识别染色体的CpG的甲基化状态，使得染色质的结构重塑；Histoneassociation：组蛋白修饰后引来SWI/SNF，进而重塑。PolIIassociation:一部分的SWI/SNF通过RNApolII的作用连接到特定的核小体上；Targetingbytranscriptionfactors:SWI/SNF通过转录因子的介导定位到特定位置上。CRM：chromatinremodelingmachinesa.DNA结合蛋白的介导b.甲基化DNA的介导c.骨架actin的介导d.乙酰化组蛋白的介导几种模型染色质重塑的几种模式A、滑动；B、重建；C、分离；D、置换滑动和重建基因表达、DNA复制等核小体上的DNA序列疏松，使得DNA结合蛋白能够与DNA结合LoopingHowepigeneticsisgenetics遗传信息是如何遗传的（传递给子代的？1.DNA的半保留复制表观遗传信息又是如何遗传的？1.H3-H4的半保留分配2.窗口学说先复制高转录活性区域，再复制异染色质保持低转录活性，不同复制窗口不一样。A.DNA复制合成过程中，父代的组蛋白拆分成四聚体，通过CAF-1填补另外一半B.DNA复制合成过程中，父代的组蛋白随机的嵌入新合成的DNA中，新合成的组蛋白随后补充空位染色质状态的遗传染色质状态的遗传1.H3.3替代H3的过程见于活性染色质；(Howtokeepthisinthedaughter?)2.DNA复制后，填入新的H3，使得活化的染色质仅占原先的一半。3.复制后，存在的那部分H3.3再启动替代H3的过程，最终达到亲代染色质相似的活性状态Whyisnucleosomepositioningimportant1.nucleosomepositioning附近提示TF（启动子）2.表达的基因，转录起始位点附近缺少N.P.3.正确的定位是DNA正确包装的条件Andmorecomplex区室化细胞的膜区室化核区室化染色质的区室化——隔离子（Insulator）——核基质附着区（MAR）

区室化的机制：CTCF与隔离子开放染色质结构：概念与意义Extendednucleosomalarray30nmfiberConstitutiveheterochromatin兼性异染色质常染色质组成异染色质开关DNA元件在发挥功能时其所处染色质需要开放染色质存在开放和关闭状态，DNA所处环境---染色质的状态影响DNA信息的表达HewishandBurgoyne,1973.200bp400bp600bp800bpOlinsandolins,1975Kornberg,1974,1975Chambon,1975Nucleosome:therepeatingunitofchromatinfiberChromatinhigherorderstructure：30nmchromatinfiberThomaetal.,JCB,1979(a)-(c)lowionicstrength,(d)-(e)moderateionicstrength,(f)-(j)highionicstrengthSalt-dependentStepwiseFoldingof30nmChromatinfiberTheimpactofchromatinstructuresontranscription开放染色质（Openchromatin）通常情况下，基因组DNA被组蛋白包裹成核小体，处于被隐藏、不可及的沉默状态。而在基因活化表达区域或调控区域，染色体会通过重塑或核小体丢失，使局部DNA形成松散不致密的开放染色质(openchromatin)这种染色质局部区域的开放与否直接影响DNA元件能否暴露在外以结合相应调控蛋白：如RNA聚合酶等转录复合体（启动子）、相关转录因子（增强子或抑制子）或CTCF等染色质构象蛋白（隔离子或LCR）。开放染色质结构：活性功能区域标志在启动子区域出现或消失的开放染色质，提示着基因转录的活化或沉默；在TSS近端顺式作用元件区域出现或消失的开放染色质，代表着该元件能否开放以确实和与转录因子结合；在基因荒漠区域或未知区域出现或消失的开放染色质则提示该区域是一新的启动子或调控元件。染色质结构变化是表观遗传调控的核心EpigeneticschromatinTranscriptionHistonevariantsChromatinremodelingNon-codingRNADNAmethylationHistonemodificationsChromatintransactorsRoeder,2010干细胞编程与重编程中的表观遗传调控网络染色质成分及反式作用因子组蛋白变体：H2A.Z，H3.3，macroH2A组蛋白修饰：Ac，Me，Ub染色质多梳蛋白复合物(PRC1andPRC2)，MBT，HP1，LaminA/C染色质调节因子组蛋白分子伴侣:NAP1,FACT,NASP染色质重塑因子:SWI/SNF,RSF,ACFDNA修饰:5mCor5hmCreprogrammingdifferentiationESCellSection4ApproachesDNA所处的环境：核小体如何检测openchromatin？Isolationofnuclei(108cells)DNaseItreatmentEmbeddedDNAintoagaroseplugDetermineddistributionofDNAusingPFGEChooseafewDNaseIconcentrationsaccordingtodistributionInvivoEnrichedforfragmentsfromHSonastreptavidincolumnIdentifyOpenchromatin：DNaseIhypersensitivityassayInvitroLigatedbiotinylatedlinkerstoDNAfragments&sonicatedtoshearDNACrawfordGetal.NatureMethods,2006CrawfordGetal.ColdSpringHarbProtoc2010Addedsecondlinker,amplified,labeledandhybridizedtotilingmicroarray研究方法研究方法：ChromatinconformatiocaptureHagegeetal.Natureprotocols,2008研究方法：ChIP(ChromatinImmunoprecipitation)forproteinbindingSection5ApplicationsHigh-resolutionmappingandcharacterizationofopenchromatinacrossthegenome.

Cell,2008.132(2):311-22.Openchromatininpluripotencyandreprogramming.NatRevMolCellBiol

12,36-47(2011).Chd1regulatesopenchromatinandpluripotencyofembryonicstemcells.Nature460,863-868(2009).Amapofopenchromatininhumanpancreaticislets.NatGenet

42,3,255-259(2010).EpigeneticinstabilityofcytokineandtranscriptionfactorgenelociunderliesplasticityoftheThelper17celllineage.Immunity32,616–627(2010).基因组注释重编程胚胎干细胞胰岛细胞Th17细胞发育104ApplicationinmonogenicdiseaseFacioscapulohumeralmusculardystrophy(FSHD)Oneofthestrangestknownautosomaldominantdiseases.Thirdmostpopularmuscledisease.D4Z4FAM149A,CYP4V2,MTNR1AFAT1ZFP42TRIML2TRIML1FRG1FRG2TUBB4QF1F2F3C1C2C31.3-Mbgenedesert

1.8-Mbgenedesert4-Mb4q35.2

DH8,9,&10DH272DHFRG1DH20DUX4DHSinthegenedesertsof4q35.2KLKB1,F11DH11&12Xuetal,Nucl.AcidsRes,2009F1F2F3C1C2C3RepeatmaskRefseqgenes187320K187360K187440K187400KFAM149ACYP4V2KLKB1F11chr4:187,290,932-187,458,654DHsitemappinginsixmyoblastcellcultures:theproximalendof4q35.2Xuetal,Nucl.AcidsRes,2009TheremayunknowngenesnearbyortheyareLCRsfordistantgenesincisOr,theymightbestructuralelementsinchromatinButtheywerenotseeninothercelltypes,musclespecific(Crawfordetal.,unpub.)

Av.FSHDstrainsGM12878K562GM12878K562HepG2IMR90DH8DH9DH10140kbAv.controlstrainsVertebrateChicken391kbtoZFP42750kbfromFAT1Xuetal,Nucl.AcidsRes,2009DHsitewasobservedatthepromoterofFRG1inallmyoblastcellstrainsDH272:preferentiallyinFSHDrelativetocontrolmyoblastsDH272:alsoseeninothercelltypes(Crawfordet.al.)overlapsaconsensusCTCFseq.&bindsCTCFinothercelltypesCTCF:implicatedinchromatinlooping,couldbeimportanttoFSHDWehavenotyetmappedCTCFsitesinmyoblasts&aredoing4CanalysesDH272istheunexpectedDHsite272kbproximaltoD4Z4DH272FRG1Control:FSHDK562K562Verte.ChickenDHFRG125kb272kbtoD4Z4125kbtoD4Z420kbMappingopenchromatinincd28/ctl4/icoslocusregionduringTcellsactivationTheCD28superfamilySharpe,ArleneH.2002Thegenomicstructureofcd28/ctla4/icoslocusCD28：促进免疫应答。CTLA-4：抑制免疫应答。ICOS：促进免疫应答。问题：cd28/ctla4/icos位点差异活化表达的基因组机制？--->1Mb基因组区域存在哪些功能元件？--->这些功能元件在活化前后的差异？GenomeAnnotation初始T细胞效应T细胞记忆T细胞CD28+CD28+，CTLA4+,ICOS+CD28+，CTLA4+,ICOS+Mappingfunctionalelementsincd28/ctla4/icosl