血清清球蛋白分离新

血清清球蛋白分离新2内容实验目的1实验原理2实验材料3实验过程45注意事项第2页,共27页，2024年2月25日，星期天3实验目的掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法了解柱层析技术第3页,共27页，2024年2月25日，星期天实验分组四个人一小组第4页,共27页，2024年2月25日，星期天5实验过程盐析（粗分离）葡聚糖凝胶层析（脱盐）DEAE纤维素离子交换层析（纯化）醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）第5页,共27页，2024年2月25日，星期天6实验材料人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液20%磺基水杨酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽第6页,共27页，2024年2月25日，星期天7实验原理蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。第7页,共27页，2024年2月25日，星期天8

蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质常用的纯化方法分子质量透析、超滤凝胶层析★离心溶解度调整pH调整离子强度★降低介电常数电荷电泳★等电聚焦离子交换层析★特异结合部位亲和层析其他性质吸附层析液相层析气相层析第8页,共27页，2024年2月25日，星期天9球蛋白

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等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A第9页,共27页，2024年2月25日，星期天101.粗提（盐析法）由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清清蛋白球蛋白半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解第10页,共27页，2024年2月25日，星期天盐析法盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。第11页,共27页，2024年2月25日，星期天122.脱盐（凝胶层析）盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。第12页,共27页，2024年2月25日，星期天凝胶层析分离示意图第13页,共27页，2024年2月25日，星期天14凝胶层析分离化合物示意图第14页,共27页，2024年2月25日，星期天153.纯化（离子交换层析）离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+阳离子交换阴离子交换R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-第15页,共27页，2024年2月25日，星期天16球蛋白

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等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A第16页,共27页，2024年2月25日，星期天0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白pI4.9，带负电荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，带负电荷少a、b球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5

，带负电荷g–球蛋白pI＞6.5，带正电荷清蛋白及a、b球蛋白被层析柱吸附,g-球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱第17页,共27页，2024年2月25日，星期天18第18页,共27页，2024年2月25日，星期天194.纯度鉴定（电泳）血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果第19页,共27页，2024年2月25日，星期天20球蛋白

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等电点4.885.065.065.126.85~7.3相对分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白A第20页,共27页，2024年2月25日，星期天21醋酸纤维素薄膜电泳原理

血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。第21页,共27页，2024年2月25日，星期天22醋酸纤维素薄膜电泳1.点样(粗面)8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多－＋小组标记样品标记第22页,共27页，2024年2月25日，星期天232.电泳薄膜粗面向下点样端置阴极端两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平注意：切勿使点样处与电泳槽接触电压：110V时间：50min。第23页,共27页，2024年2月25日，星期天243.染色和漂洗电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。第24页,共27页，2024年2月25日，星期天用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质凝胶柱层析除盐磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤BaCl2检测SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用2ml0.02mol/LNH4AC缓冲液洗涤BaCl2检测SO42-阴性用2~3ml0.02mol/LNH4AC缓冲液再生平衡盐析操作流程离子交换柱层析纯化加样加样第25页,共27页，2024年2月25日，星期天用1ml0.0６mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５mL0.06mol/LNH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白离子交换柱层纯化除盐后收集的清蛋白用1ml0.02mol/LNH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/LpH6.5NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白除盐后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）用0.3mol/LNH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管DEAE-纤维素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC缓冲液流洗再生平衡离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)第26页,共27页，2024年2月25日，星期天27注意事项所用血清应新鲜