生物技术制药第2版-第5章-疫苗及其制备技术

章

疫苗及其制备技术

2021/3/29星期一1疫苗（Vaccine）传统概念：将病原微生物（细菌、病毒、真菌等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂。世界卫生组织的扩大免疫措施（EPI）——儿童免疫程序表2021/3/29星期一2、成人2021/3/29星期一3现代疫苗：治疗性疫苗、非感染性疾病疫苗疫苗学（Vaccinology）2021/3/29星期一4本章学习要求掌握：疫苗、基因工程疫苗、联合疫苗的概念及常见疫苗的制备技术熟悉：疫苗的原理、类型、特点及主要用途了解：疫苗发展的历程与趋势、疫苗产业的特点与应用2021/3/29星期一5本章内容概述疫苗的组成、作用原理、类型与特点疫苗的制备方法疫苗生产的质量控制疫苗产业的特点及应用概况2021/3/29星期一6第一节概述一、疫苗的产生“12世纪，中国开始用人痘接种预防天花”《疫苗可预防疾病的流行病学与预防学》

第6版，美国疾病控制与预防中心（CDC）2000年出版

2021/3/29星期一7一、疫苗的产生天花（Smallpox）由天花病毒引起的一种烈性传染病天花病毒：呈砖形，能对抗干燥和低温，在痂皮、尘土和被服上可生存数月至一年半之久临床表现：主要为严重毒血症状、皮肤成批依次出现斑疹、丘疹、疱疹、脓疱，最后结痂、脱痂，遗留痘疤。传播途径：飞沫吸入或直接接触。特点：发展迅速，未免疫人群感染后15-20天内致死率高达30％。2021/3/29星期一8一、疫苗的产生天花的防治——中国宋真宗时期（998-1023年）：人痘法，吸入天花病人痂粉预防天花。明朝隆庆年间（1567-1572年）：痘衣法、痘浆法、旱痘法和水苗法等多种接种方法出现。清朝顺治死于天花，得过天花的康熙继位人痘法的缺点：有时也会引起严重的天花2021/3/29星期一9一、疫苗的产生天花的防治——欧洲1721年，人痘接种法传入英国1796年，英国医生E.Jenner利用牛痘防治天花1798年，医学界正式承认“疫苗接种确实是一种行之有效的免疫方法”。细胞培养法获得天花病毒——牛痘苗2021/3/29星期一102021/3/29星期一11一、疫苗的产生疫苗之父法国免疫学家LouisPasteur鸡霍乱弧菌减毒株（第一个细菌减毒活疫苗）2021/3/29星期一12一、疫苗的产生巴斯德与狂犬病疫苗异体传代法：将狂犬病毒在兔体内经连续传代，获得了减毒株2021/3/29星期一13一、疫苗的产生巴斯德在疫苗领域的卓越贡献细菌的分离培养技术减毒菌株的获得连续传代培养法高温培养法异体传代法巴氏减毒菌苗的发明：为实验免疫学建立了基础2021/3/29星期一14二、疫苗及其技术的发展简史（一）减毒活疫苗技术——第一次疫苗革命（二）基因重组疫苗技术——第二次疫苗革命（三）反向疫苗学技术——第三次疫苗革命2021/3/29星期一15二、疫苗及其技术的发展简史（一）减毒活疫苗技术——细胞水平人为处理使病原微生物失去毒力或降低毒力例：卡介苗（BacillusCalmette-Guérin,BCG，使用活的无毒牛型结核杆菌制成）、炭疽疫苗、狂犬疫苗2021/3/29星期一16二、疫苗及其技术的发展简史药物毒理：结核菌是细胞内寄生菌——细胞免疫用无毒卡介菌（结核菌）人工接种进行初次感染，经过巨噬细胞的加工处理，将其抗原信息传递给免疫活性细胞，使T细胞分化增殖，形成致敏淋巴细胞，当机体再遇到结核菌感染时，巨噬细胞和致敏淋巴细胞迅速被激活，执行免疫功能，引起特异性免疫反应。2021/3/29星期一17二、疫苗及其技术的发展简史（二）基因重组疫苗技术——分子水平基因重组技术研究相关基因和蛋白质产物例：乙肝疫苗（乙型肝炎表面抗原）2021/3/29星期一18二、疫苗及其技术的发展简史血源乙肝疫苗：无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg，经纯化，灭活及添加佐剂制成。基因重组（转基因）乙肝疫苗：利用转基因技术，构建含有乙肝病毒HBsAg基因的重组质粒，转入酵母（或重组CHO细胞）表达乙型肝炎表面抗原，在繁殖过程中产生未糖基化的HBsAg多肽，经破碎酵母菌体，颗粒形未糖基化的HBsAg多肽释放，经纯化，灭活，添加佐剂制成。

2021/3/29星期一19二、疫苗及其技术的发展简史基因工程技术在疫苗领域应用构建无毒或减毒疫苗：毒素基因突变构建载体活疫苗：目的基因克隆至临床常规使用的活疫苗中2021/3/29星期一20二、疫苗及其技术的发展简史（三）反向疫苗学技术——蛋白质水平全基因水平筛选具有保护性免疫反应的候选抗原具体步骤：1.基因组信息分析结合基因芯片筛选候选疫苗成分2.高通量基因重组表达候选疫苗蛋白成分3.免疫保护性测试2021/3/29星期一21二、疫苗及其技术的发展简史例：B型脑膜炎球菌（meningococcusB）

先用计算机分析B型脑膜炎球菌的基因组，找到600个潜在的疫苗候补，将其中350个在大肠杆菌中进行表达，然后将蛋白提纯用于免疫小鼠，其中找到29个蛋白能诱导小鼠产生抗体，从而达到预防免疫的作用。2021/3/29星期一22第二节

疫苗的组成、作用原理、类型与特点一、疫苗组成抗原佐剂防腐剂稳定剂灭活剂缓冲液、盐类等非活性成分2021/3/29星期一23一、疫苗组成1.抗原（antigen，Ag）疫苗最主要的有效活性成分免疫原性（immunogenicity）：刺激机体特异性免疫细胞活化、增殖、分化并产生免疫效应物。免疫反应性（immunoreactivity）：与免疫效应物发生特异性结合而产生免疫反应。2021/3/29星期一24一、疫苗组成常用抗原包括：

灭活病毒或细菌活病毒或细菌（减毒株）病毒或菌体提纯物有效蛋白成分类毒素细菌多糖合成多肽

核酸2021/3/29星期一252.佐剂（adjuvant）非特异性增强抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质。要求：安全无毒、在非冷藏条件下稳定作用机制：

改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间刺激单核巨噬细胞对抗原的递呈能力

刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力一、疫苗组成2021/3/29星期一26一、疫苗组成常用佐剂：用于人体：铝佐剂/MF59（水包油的乳剂）动物试验：弗氏完全佐剂（FCA）/弗氏不完全佐剂（FIA）2021/3/29星期一273.防腐剂大多数的灭活疫苗都使用防腐剂目的：防止外来微生物的污染常用：0.01％～0.02％硫柳汞2-苯氧乙醇氯仿副作用：接触性皮炎、变应性结膜炎、耳毒性一、疫苗组成2021/3/29星期一284.稳定剂目的：保证作为抗原的病毒或其他微生物存活，并保持免疫原性冻干疫苗中常用：乳糖、明胶、山梨醇等。

一、疫苗组成2021/3/29星期一295.灭活剂灭活病毒或细菌抗原的方法：

物理方法（如加热、紫外线照射等）

化学方法（丙酮、酚、甲醛等）对人体有一定毒害作用，因此在灭活抗原后必须及时从疫苗中除去，并经严格检定以保证疫苗的安全性。一、疫苗组成2021/3/29星期一306.缓冲液、盐类缓冲液的种类、盐类的含量都可影响疫苗的效力、纯度和安全性，因此都有严格的质量标准一、疫苗组成2021/3/29星期一31二、疫苗作用原理当机体经过口服或注射等途径接种疫苗后，其中的抗原分子刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质当机体再次接触到相同病原菌抗原时，免疫系统依循免疫记忆，迅速制造出保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害而获得保护。2021/3/29星期一32三、疫苗的类型与特点（一）减毒活疫苗（二）灭活疫苗（三）亚单位疫苗（四）联合疫苗（五）核酸疫苗（六）治疗性疫苗2021/3/29星期一33三、疫苗的类型与特点（一）减毒活疫苗（liveattenuatedvaccine）通过一定方法使病原体的致病性减弱或丧失后获得的由完整微生物组成的疫苗制品特点：能引发机体感染但不发生临床症状，但其免疫原性可引发机体免疫反应，刺激机体产生特异性的记忆B细胞和记忆T细胞，起到获得长期或终生保护的作用。

2021/3/29星期一34三、疫苗的类型与特点优点：接种次数少，反应小，免疫效果好（体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫），成本低缺点：稳定性差，有毒力返祖现象，污染环境，免疫缺陷者不能接种2021/3/29星期一35三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一36三、疫苗的类型与特点（二）灭活疫苗（inactivatedvaccine）将病原体经培养增殖、灭活、纯化处理后获得的保留病原体几乎全部组分的疫苗制品。特点：失去了病原体的感染性，但保留了较强的免疫原性和较好的安全性2021/3/29星期一37三、疫苗的类型与特点优点：稳定性好，反应小，免疫缺陷者也可接种缺点：需多次接种，免疫效果较差（体液免疫），需要量大2021/3/29星期一38三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一39三、疫苗的类型与特点（三）亚单位疫苗（subunitvaccine）

利用微生物的某种表面结构成分制成的能诱发机体产生抗体的疫苗制品。分类：纯化亚单位疫苗：单个蛋白或寡糖组成、佐剂合成肽亚单位疫苗：抗病毒/肿瘤/细菌、寄生虫感染基因工程亚单位疫苗2021/3/29星期一40三、疫苗的类型与特点基因工程亚单位疫苗（geneticengineeringsubunitvaccine）在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入非致病性微生物内表达产物，然后通过分离纯化获得的特异蛋白质。原核细胞（大肠杆菌）、真核细胞（酵母）活载体疫苗（细菌、病毒）、转基因植物疫苗2021/3/29星期一41三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一42三、疫苗的类型与特点（四）联合疫苗（combinedvaccine）两种或两种以上抗原物理混合后制成的疫苗制剂。多联疫苗（multi-combinedvaccine）：预防不同病原微生物引起的传染病（例：百白破）多价疫苗（multivalentvaccine）：预防由同一病原微生物不同亚型引起的传染病（例：23价肺炎多糖疫苗）2021/3/29星期一43三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一44三、疫苗的类型与特点（五）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）也称基因疫苗（geneticvaccine），包括DNA疫苗和RNA疫苗。由抗原的编码基因和载体组成，导入机体细胞后可通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞和体液免疫应答的疫苗制剂。2021/3/29星期一45三、疫苗的类型与特点DNA疫苗（DNAvaccine）将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，导入宿主细胞内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。特点：免疫效果好，制备方便，可重复使用，可用于免疫治疗和联合免疫2021/3/29星期一46三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一47三、疫苗的类型与特点（六）治疗性疫苗（therapeuticvaccine）在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的疫苗制品。最早的治疗性疫苗：狂犬病疫苗2021/3/29星期一48三、疫苗的类型与特点1.基于组成成分及性质的分类（1）蛋白质复合重构的治疗性疫苗改造靶抗原的结构或组合，使其相似而又有异于传统疫苗的靶抗原，重新唤起患者的功能性免疫应答，进而打破和逆转患者的免疫耐受状态。改造方法：蛋白修饰，结构/构型改造，蛋白复合/多肽偶联2021/3/29星期一49三、疫苗的类型与特点（2）基因疫苗DNA疫苗：埃博拉（Ebola）疫苗、乙型肝炎（HBV）疫苗、丙型肝炎（HCV）疫苗、人免疫缺陷病毒（HIV）疫苗等RNA疫苗：RNA修饰的树突状细胞（DC）疫苗等2021/3/29星期一50三、疫苗的类型与特点（3）多水平基因修饰细胞疫苗肿瘤治疗性疫苗：肿瘤细胞/DC细胞疫苗制备过程：2021/3/29星期一51三、疫苗的类型与特点2.基于治疗疾病种类的分类（1）感染性疾病的治疗性疫苗（2）肿瘤治疗性疫苗（3）自身免疫性疾病的治疗性疫苗（4）移植用治疗性疫苗2021/3/29星期一52三、疫苗的类型与特点2021/3/29星期一53三、疫苗的类型与特点预防性疫苗治疗性疫苗病原体蛋白不需改造需经分子设计和重新构建受用者健康人体患者监测手段保护性抗体产生情况疾病改善情况激发免疫应答类型体液免疫为主细胞免疫为主2021/3/29星期一54第三节疫苗的制备方法灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗减毒活疫苗——皮内注射用卡介苗基因工程重组亚单位疫苗——重组乙型肝炎疫苗生化提取亚单位组分疫苗——吸附破伤风疫苗治疗性疫苗——前列腺癌疫苗Sipuleucel-T2021/3/29星期一55疫苗生产的一般流程2021/3/29星期一56一、灭活全毒疫苗——流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）本品系用世界卫生组织（WHO）推荐的并经国家食品药品监督管理局批准的流感病毒株，分别接种鸡胚，经培养、收获病毒液，病毒灭活、浓缩和纯化后制成。用于预防本株病毒引起的流行性感冒2021/3/29星期一57一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）The

influenzavaccineisanannualvaccinationusingavaccinethatisspecificforagivenyeartoprotectagainstthehighlyvariable

influenzavirus.

Eachseasonalinfluenzavaccinecontainsantigensrepresentingthree(trivalentvaccine)orfour(quadrivalentvaccine)influenza

virusstrains:twoinfluenzatypeAvirusstrains,andeitheroneortwoinfluenzatypeBvirusstrains.

2021/3/29星期一58流感病毒甲型流感病毒（InfluenzaAvirus）最容易发生变异（抗原转变、抗原漂移）世界性流感大流行：甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起甲型流感病毒根据H(hemagglutinin，血凝素)和N(neuraminidase，神经氨酸酶)抗原不同分为许多亚型，H有17个亚型（H1～H17），N有10个亚型（N1～N10）。H1、H5、H7亚型为高致病性2021/3/29星期一59流感病毒乙型流感病毒（InfluenzaBvirus）抗原变异很慢局限性流行，对人类致病性较低丙型流感病毒（InfluenzaCvirus）抗原稳定致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群，只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染2021/3/29星期一60一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）Influenzavaccinesmaybe

administered

asaninjection

orasanasalspray.TheU.S.

CentersforDiseaseControlandPreventionrecommendthateveryoneovertheagesof6monthsshouldreceivetheseasonalinfluenzavaccine.

Vaccinationcampaigns

usuallyfocusonpeoplewhoareathighriskof

seriouscomplications

iftheycatchtheflu,suchastheelderlyandpeoplelivingwithchronicillness

orthosewith

weakenedimmunesystems,aswellashealthcareworkers.2021/3/29星期一61一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）（一）制备方法1.生产用原材料鸡胚是分离各类病毒的较为理想的材料尿囊腔2021/3/29星期一62一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）（1）鸡胚毒种传代和制备：来源于SPF（SpecificpathogenFree）鸡群疫苗生产：来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群、9-11日龄无畸形、血管清晰、活动（2）毒种WHO推荐并提供的甲型和乙型流感病毒株2021/3/29星期一63一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）2.毒种种子批的建立及检定符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定2021/3/29星期一64一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）2.毒种种子批的建立及检定建立：以毒种为基础传代（5代以内得成品疫苗）血凝素型别鉴定试验血凝抑制试验

单向免疫扩散试验病毒滴度：鸡胚半数感染剂量法血凝滴度：血凝法无菌检查、支原体检查外源性禽白血病病毒、禽腺病毒检测：ELISA保存：冻干毒种-20℃以下，液体毒种-60℃以下检定2021/3/29星期一65一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）3.单价原液的制备各流感病毒工作种子批分别接种（尿囊腔），33-35℃培养48-72h病毒收获（尿囊液）收获液检定

微生物限度：菌数<105CFU/ml，沙门氏菌为阴性血凝滴度收获液合并2021/3/29星期一66一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）3.单价原液的制备病毒灭活（甲醛≤200μg/ml）、验证及内毒素含量测定浓缩（超滤）、纯化（柱色谱法、蔗糖密度区带离心）及过滤除菌（硫柳汞）单价原液保存（2-8℃）2021/3/29星期一67一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）4.半成品的制备对单价原液根据相同血凝素含量进行配制：15-18μg/剂补加硫柳汞5.成品的制备半成品分批、分装及冻干后包装：0.5-1.0ml/剂，含各型流感病毒株血凝素为15μg/剂2021/3/29星期一68一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）（二）检定要求1.单价原液的检定鉴别试验：血凝抑制试验、单向免疫扩散试验病毒灭活验证试验：鸡胚存活率、血凝试验血凝素含量检测：单向免疫扩散试验2021/3/29星期一69一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）2.半成品的检定游离甲醛含量≤50μg/剂硫柳汞含量≤50μg/剂血凝素含量：配制量的80%-120%无菌检查2021/3/29星期一70一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）3.成品的检定鉴别：单向免疫扩散试验外观：乳白色液体，无异物pH值：6.8-8.0硫柳汞含量≤50μg/剂蛋白质含量≤200μg/剂血凝素含量：配制量的80%-120%卵清蛋白含量≤250ng/剂抗生素残留量≤50ng/剂2021/3/29星期一71一、流感全病毒灭活疫苗（inactiatedinfluenzawholevirionvaccine）2021/3/29星期一72二、减毒活疫苗——皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）本品系用卡介菌经培养后，收集菌体，加入稳定剂冻干制成2021/3/29星期一73二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）（一）基本要求生产车间、设备及器具专用制造、包装过程避光工作人员：身体健康、无结核病2021/3/29星期一74二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）（二）制备方法1.生产用菌种：符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定卡介菌D2PB302菌株2021/3/29星期一75二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）2.种子批的建立及检定(<12代)培养特性：菌落特征（多皱、微黄菌膜）毒力试验（豚鼠腹腔注射）：体重不减轻，解剖观察无有毒分枝杆菌试验（豚鼠皮下注射）：体重不减轻，解剖观察免疫力试验（豚鼠皮下注射）：解剖分析保存：冻干，8℃以下2021/3/29星期一76二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）3.原液的制备生产用种子：工作种子批生产用培养基：液体苏通培养基等接种与培养：37-39℃静止培养收获和合并：收集菌膜，压干，研磨，加入稳定剂稀释2021/3/29星期一77二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）4.半成品的制备稳定剂稀释：0.5-1.0mg/ml5.成品的制备分装、冻干、封口保存2021/3/29星期一78二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）（三）检定要求1.原液检定纯菌检查：涂片镜检浓度测定：参照标准品，分光光度法检测2.半成品的检定沉降率测定：静置，分光光度法检测活菌数测定≥1.0×107CFU/mg活力测定：XTT法2021/3/29星期一79二、皮内注射用卡介苗（BCGvaccineforintradermalinjection）3.成品的检定鉴别试验：抗酸染色涂片外观：白色疏松体或粉末状，加水成均匀悬液水分≤3.0%效力测定（豚鼠皮下注射）：局部硬结反应活菌数测定≥1.0×106CFU/mg无有毒分支杆菌试验（豚鼠皮下注射）：体重不减轻，解剖观察热稳定性试验：37℃放置28天，计算活菌率2021/3/29星期一80三、基因工程亚单位疫苗——重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）由重组酵母细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。2021/3/29星期一81三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）（一）制备方法1.生产用菌种：基因重组构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母原始菌种2021/3/29星期一82三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）2.种子批的建立及检定符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定建立：原始菌种传代培养物纯度：无细菌和其他真菌检出HBsAg基因序列测定检定质粒保有率：平板复制法活菌率：血细胞计数板抗原表达率：蛋白质含量、HBsAg含量保存：工作种子批-70℃保存，其余液氮保存2021/3/29星期一83三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）3.原液的制备发酵：锥形瓶、种子罐、生产罐三级发酵纯化：细胞破碎（TritonX-100）、硅胶吸附、疏水色谱纯化、硫氰酸盐处理、稀释、过滤除菌保存：2-8℃，不超过3个月2021/3/29星期一84三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）4.半成品的制备甲醛处理：100μg/ml铝吸附配制：与铝佐剂等量混合5.成品的制备分批、分装及冻干后包装2021/3/29星期一85三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）（二）检定要求1.原液检定特异蛋白带：SDS，20-25kD蛋白带N-端氨基酸序列测定：氨基酸序列分析仪纯度：免疫印迹法、高效液相色谱法2.半成品的检定吸附完全性≥95%硫氰酸盐含量＜1.0μg/mlTritonX-100含量＜15.0μg/ml2021/3/29星期一86三、重组乙型肝炎疫苗（recombinantHepatitisBvaccine）3.成品的检定鉴别试验：ELISA外观：乳白色混悬液pH值：5.5-7.2铝含量:0.35-0.62mg/ml2021/3/29星期一87四、生化提取亚单位组分疫苗——吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）本品系采用破伤风梭状芽孢杆菌，在适宜的培养基中培养后提取破伤风毒素蛋白经甲醛脱毒、精制，加入氢氧化铝佐剂制成。2021/3/29星期一88四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）（一）制备方法1.生产用菌种：产毒效价高、免疫力强的破伤风梭状芽孢杆菌2021/3/29星期一89四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）2.种子批的建立及检定符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定建立：原始菌种传代培养特性：专性厌氧菌、培养观察染色镜检：革兰氏染色检定生化反应：不发酵糖类、不还原硝酸盐等产毒试验(小鼠皮下注射)：观察症状特异性中和试验(小鼠皮下注射)：观察症状保存：2-8℃2021/3/29星期一90四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）3.类毒素原液的制备毒素的获得：微生物培养，离心上清，除菌过滤脱毒（甲醛）及检定（豚鼠皮下注射）：体重、症状精制：等电点沉淀、盐析、超滤等，加硫柳汞保存：2-8℃2021/3/29星期一91四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）4.半成品的制备佐剂配制：氢氧化铝吸附类毒素的配制：7-10Lf/ml5.成品的制备分批、分装、冻干后包装2021/3/29星期一92四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）（二）检定要求1.类毒素原液检定pH值：6.6-7.4纯度：1500Lf/mg蛋白氮特异性毒性检查（豚鼠皮下注射）：体重、症状毒性逆转实验（豚鼠皮下注射）：体重、症状2.半成品的检定无菌检查2021/3/29星期一93四、吸附破伤风疫苗（adsorbedtetanusvaccine）3.成品的检定鉴别试验：动物实验、絮状试验、凝胶免疫沉淀外观：乳白色悬液化学检定：pH、氢氧化铝、硫柳汞、甲醛等含量效价测定≥40IU/剂特异性毒性检查（豚鼠皮下注射）：体重、症状2021/3/29星期一94五、治疗性疫苗——前列腺癌疫苗Sipuleucel-TDENDREON公司的自体细胞免疫疗法2010年批准上市，首个被FDA批准的治疗性癌症疫苗2021/3/29星期一95五、治疗性疫苗——前列腺癌疫苗Sipuleucel-T基本步骤:采集患者的外周血单个核细胞，培养生成抗原提呈细胞（树枝状细胞)树枝状细胞在培养条件下用基因工程制备的融合蛋白（PA2024）孵育,这种融合蛋白由两部分组成:抗原-前列腺酸性磷酸酶（PAP），PAP能在95%的前列腺癌细胞中表达;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF),一种能帮助树枝状细胞成熟和激活的免疫信号因子收集经融合蛋白孵育刺激的树枝状细胞等免疫活性细胞重新注入患者体内,激发体内产生针对携带PAP抗原的前列腺癌细胞的抗肿瘤免疫反应2021/3/29星期一96第四节疫苗生产的质量控制2021/3/29星期一972021/3/29星期一982021/3/29星期一992021/3/29星期一1002021/3/29星期一1012021/3/29星期一102一、原材料的质量控制（一）生产用水（二）器材、溶液等原材料（三）动物源的原材料：SPF级（四）菌种和毒种（五）细胞2021/3/29星期一103（四）菌种和毒种2021/3/29星期一1042021/3/29星期一105二、生产过程质量控制《中国生物制品规程》GMP人员素质、卫生及无菌的要求2021/3/29星期一1062021/3/29星期一1072021/3/29星期一108三、疫苗产品的质量控制（一）理化检定检测疫苗中的有效成分和无效有害成分物理性状检查蛋白质含量测定：基因工程疫苗防腐剂含量测定纯度检查其他：水分、佐剂等2021/3/29星期一109三、疫苗产品的质量控制（二）安全性检定菌、毒种和主要原材料的检查半成品检查成品检查2021/3/29星期一110三、疫苗产品的质量控制（三）效力检定免疫力试验活疫苗的效力测定血清学试验2021/3/29星期一1112021/3/29星期一1122021/3/29星期一113第五节疫苗产业特点及应用概况疫苗行业是生物医药领域中比较高端的细分领域，具有较高的技术壁垒、资金壁垒和政策壁垒。

全球疫苗85%的疫苗市场被葛兰素史克、赛诺菲安万特、默克、惠氏和诺华这五家跨国制药企业所垄断。我国疫苗市场规模已接近100亿元，全世界排名前10位的制药公司已全部进军中国市场。2021/3/29星期一114一、疫苗研发生产特点需全程监管研发是疫苗供应体系的核心周期长、投入高、风险大：10年以上一条生产线只生产一种产品对大规模产业化生产技术的需求高投入产出比高2021/3/29星期一115二、我国疫苗分类及需求政府免费向公民提供、公民依照政府规定接种公民自愿接种、自费负担2021/3/29星期一116三、我国疫苗行业现状流通领域的开放和计划免疫范围的扩大，加强计划疫苗需求，激活有价疫苗市场加大传统疫苗的技术改良与新型疫苗品种的开发力度展开从产品竞争到企业竞争的双重竞争2021/3/29星期一117四、接种疫苗的效果1.人用疫苗彻底消灭天花基本消灭脊髓灰质炎麻疹、百日咳、白喉、流行性乙脑炎、流行性脑脊髓膜炎等发病率大幅下降2.兽用疫苗2021/3/29星期一118五、面临的形势和挑战全球性需求和发展加快关键技术、装备研发、