选修第二三章克隆技术胚胎工程

选修第二三章克隆技术胚胎工程克隆（clone)指无性繁殖系:指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体。第一节什么是克隆克隆技术（cloning)表示整个无性繁殖的过程。1、概念第2页,共90页，2024年2月25日，星期天2、克隆类型

基因克隆（分子水平）细胞克隆（细胞水平）个体克隆（个体水平）如：PCR技术如：动物细胞培养；细菌繁殖如：植物组织培养；多莉羊第3页,共90页，2024年2月25日，星期天理论条件：细胞(主要是细胞核)具有全能性。（具有克隆的潜能）基本条件（主要针对高等动物）：(1)具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞。(2)能有效调控细胞核发育的细胞质物质(如去核的卵细胞)。(3)完成胚胎发育的必要的环境条件(诱导核质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境)。3、克隆的条件P20第4页,共90页，2024年2月25日，星期天第二节植物的克隆1、植物组织培养植物克隆的技术基础是植物组织培养第5页,共90页，2024年2月25日，星期天（1）植物组织培养的过程外植体愈伤组织胚状体或根、芽等植物体脱分化再分化愈伤组织无菌培养基无菌培养基第6页,共90页，2024年2月25日，星期天你认为培养基应有哪些成分?你认为培养基应该是哪种物理状态?与无土栽培培养液比较植物组织培养的培养基培养基的成分矿质元素蔗糖

植物激素维生素有机添加物琼脂等生长素和细胞分裂素第7页,共90页，2024年2月25日，星期天人工种子的制作——解决有些作物繁殖能力差,结子困难,发芽率低等问题。生根发芽能力的胚状体用人工种皮(藻酸钠)包被人工种子.天然种子和人工种子在生殖方式上有什么不同?第8页,共90页，2024年2月25日，星期天（2）植物组织培养技术的应用（1）快速繁殖,培育无病毒植物(植物克隆,珍稀、濒危物种).蝴蝶兰脱毒生姜第9页,共90页，2024年2月25日，星期天紫草紫草素愈伤组织（2）通过大规模组织培养,生产药物、食品添加剂、香料、色素、杀虫剂等.第10页,共90页，2024年2月25日，星期天如何去除细胞壁？原生质体——植物细胞除去壁后的部分(通常呈球形)2、原生质体培养及其应用第11页,共90页，2024年2月25日，星期天原生质体的制备植物细胞(较高渗透压)0.5~0.6mol/L的甘露醇纤维素酶和果胶酶球型原生质体第12页,共90页，2024年2月25日，星期天植物体细胞杂交第13页,共90页，2024年2月25日，星期天第三节动物的克隆

动物克隆的技术基础是动物细胞和组织培养,动物细胞培养也是细胞生物学的主要技术基础.第14页,共90页，2024年2月25日，星期天单个细胞细胞系或细胞株剪碎

胰蛋白酶原代培养传代培养动物细胞培养过程动物的组织1、动物细胞培养第15页,共90页，2024年2月25日，星期天需要哪些营养?你认为培养基应是什么物理性状的培养基？主要有哪些成分?葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐、动物血清（促生长因子）等。第16页,共90页，2024年2月25日，星期天血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%～20%的血清。为什么常要添加血清？第17页,共90页，2024年2月25日，星期天营养（液体培养基）：适宜的温度和pH：气体环境无菌、无毒环境仪器培养动物细胞还需要哪些适宜条件？36.5±0.5℃；pH=7.2～7.4。如何维持？用CO2培养箱，(95%空气和5%CO2)，维持培养液的pHCO2

、O2等添加一定量的抗生素，定期更换培养液水、无机盐、葡萄糖、动物血清等第18页,共90页，2024年2月25日，星期天原代培养与传代培养………………原代培养传代培养第19页,共90页，2024年2月25日，星期天细胞贴壁过程第20页,共90页，2024年2月25日，星期天细胞在贴壁生长过程中,随着细胞分裂,数量不断增加,最后形成一个单层,此时细胞间相互接触,细胞分裂和生长停止。接触抑制第21页,共90页，2024年2月25日，星期天把一个单细胞从细胞群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。

细胞克隆的最基本要求必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个，即必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。1、克隆培养法（细胞克隆）二、应用第22页,共90页，2024年2月25日，星期天提高细胞克隆形成率的措施:(1)选择适宜的培养基、添加动物血清

(2)以滋养细胞支持生长

(3)激素刺激（如胰岛素等）

(4)使用CO2培养箱调节pH第23页,共90页，2024年2月25日，星期天植物组织培养和动物细胞培养的比较P200比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果应用（举例）细胞的全能性细胞增殖通常固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系如：快速繁殖、培育无病毒植株如：获得细胞或细胞分泌蛋白第24页,共90页，2024年2月25日，星期天

细胞融合：

指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。

不同基因型的细胞之间的融合就是细胞杂交。2、动物细胞融合技术及应用第25页,共90页，2024年2月25日，星期天诱导融合的因素生物法：灭活的仙台病毒诱导融合利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。化学法：聚乙二醇诱导融合因为聚乙二醇易得、简便，且融合效果稳定，是目前应用最广泛的方法。物理法：电激、激光诱导融合病毒颗粒黏附细胞表面细胞膜连接细胞膜被病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞第26页,共90页，2024年2月25日，星期天动物细胞融合技术的应用

由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。

利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。第27页,共90页，2024年2月25日，星期天检测抗原用什么检测？相应的抗体一般来说，医院如何检测人体内是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式图

第28页,共90页，2024年2月25日，星期天

第29页,共90页，2024年2月25日，星期天决定抗原特异性的特定部位----如1、2

由几个氨基酸组成，具有特定的空间结构第30页,共90页，2024年2月25日，星期天

人们如何获得针对某种抗原的抗体?

传统的方法是什么？第31页,共90页，2024年2月25日，星期天第32页,共90页，2024年2月25日，星期天用从血清中获得的抗体进行检验时，有时会出现假阳性。没乙肝病毒的，被误检为有乙肝病毒。这是怎么回事？第33页,共90页，2024年2月25日，星期天

2

1ABC用这样的抗体进行检测，特异性差。如何解决这一问题？血清中的抗体：第34页,共90页，2024年2月25日，星期天（单克隆抗体）单个B淋巴细胞细胞群克隆化学性质单一、特异性强的抗体产生一个B淋巴细胞只产生一种特异性抗体在体外：第35页,共90页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体需要解决的问题：

B淋巴细胞如何在体外培养条件下无限增殖解决的方法：

利用动物细胞融合技术，使B淋巴细胞与一种能够在体外无限增殖的细胞融合骨髓瘤细胞第36页,共90页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体

——极富创造性的方案1975年米尔斯坦与科勒合作研制出了单克隆抗体技术，于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。单克隆抗体技术几乎对生理学和医学的所有领域都产生了深远的影响，给许多疾病的诊断和治疗带来革命性的变化。柯勒(1946～)德国免疫学家米尔斯坦(1927～2002)阿根廷裔英国生物化学家第37页,共90页，2024年2月25日，星期天动物免疫分离B淋巴细胞细胞融合——淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选克隆能产生抗体的细胞单克隆抗体的纯化单抗的制备过程第38页,共90页，2024年2月25日，星期天单克隆抗

体的制备动物体注射抗原效应B细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞能产生特定抗体的杂交瘤细胞群获得足够量的细胞从培养液中提取抗体从小鼠的腹水中提取抗体获得细胞融合筛选细胞培养筛选继续培养体外培养体内培养B淋巴细胞—B淋巴细胞骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞杂交瘤细胞多种杂交瘤细胞特定的选择培养基抗体检验（多次）第39页,共90页，2024年2月25日，星期天单克隆抗体的应用疾病诊断、治疗和预防——如单抗诊断盒用单克隆抗体与抗癌药物连接，用于治疗癌症——“生物导弹”“人T淋巴细胞亚群双色荧光标记单抗分型试剂盒”单克隆抗体药物Zevalin第40页,共90页，2024年2月25日，星期天项目动物细胞融合植物体细胞杂交原理细胞膜的流动性及细胞增殖细胞膜的流动性及细胞的全能性诱导手段除物理、化学方法外还可用灭活的病毒物理、化学方法

酶胰蛋白酶纤维素酶和果胶酶结果杂种细胞群杂种植株应用制备单克隆抗体等培育白菜—甘蓝等动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较第41页,共90页，2024年2月25日，星期天B羊卵细胞A羊乳腺细胞取核去核重组细胞发育早期胚胎移至C羊子宫内克隆羊为什么选卵细胞接受核？用了哪些细胞工程技术？属于什么生殖方式？是否遵循孟德尔定律？多莉性别？性状情况？3、动物的克隆繁殖第42页,共90页，2024年2月25日，星期天第三章胚胎工程第43页,共90页，2024年2月25日，星期天第一节从受精卵谈起第44页,共90页，2024年2月25日，星期天胚胎发育胚后发育幼体性成熟个体受精卵动物的个体发育第45页,共90页，2024年2月25日，星期天充满活力的精子卵细胞哺乳动物受精过程示意图第46页,共90页，2024年2月25日，星期天经过种种障碍的精子奋力向卵细胞游去第47页,共90页，2024年2月25日，星期天第48页,共90页，2024年2月25日，星期天精子进入卵子后，其细胞核变大到和卵子细胞核相似，精核和卵核同时向细胞中部靠拢，并相互融合成一个细胞核，这时称受精卵。形成受精卵：第49页,共90页，2024年2月25日，星期天一、受精作用1、受精：成熟的精卵融合成为受精卵的过程2、受精过程：精卵识别、精子附着于卵膜、精卵质膜融合3、精卵识别的基础：4、场所：细胞表面的特异性蛋白输卵管第50页,共90页，2024年2月25日，星期天囊胚期8细胞期受精卵2细胞期4细胞期16细胞期32细胞期原肠胚期卵裂内胚层外胚层中胚层二、胚胎发育过程第51页,共90页，2024年2月25日，星期天受精卵卵裂球细胞数量？胚胎总体积？每个细胞体积？总DNA含量，总有机物含量？总表面积与体积比值？卵裂球含2－8个细胞时，全部细胞都具有全能性卵裂胚胎发育过程第52页,共90页，2024年2月25日，星期天桑椹胚受精卵卵裂球卵裂第53页,共90页，2024年2月25日，星期天囊胚期滋养层：囊胚腔内细胞团：已出现细胞分化具有发育的全能性，是胚胎干细胞，将分化成所有组织器官

一层扁平细胞，发育成胚胎的附属结构或胚外结构桑椹胚受精卵卵裂球卵裂第54页,共90页，2024年2月25日，星期天蛙原肠胚剖面图原肠腔外胚层中胚层内胚层胚孔缩小的囊胚腔(一孔、二腔、三胚层)原肠胚囊胚期桑椹胚受精卵卵裂球卵裂第55页,共90页，2024年2月25日，星期天原肠胚阶段是个体发育中分化程度最高的阶段。器官原基形成原肠胚囊胚(胚泡)桑椹胚受精卵卵裂球卵裂第56页,共90页，2024年2月25日，星期天受精卵卵裂期桑椹胚囊胚原肠胚组织器官形成：在透明带内进行有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎总体积并不增加，或略有减少。：由具有全能性细胞构成，细胞数在32个左右，排列紧密，形似桑椹内细胞团：发育成胎儿各组织滋养层细胞：发育成胎膜和胎盘最初发育在输卵管进行有丝分裂外胚层中胚层内胚层原肠腔胚胎的早期培养第57页,共90页，2024年2月25日，星期天下列关于受精作用及结果的叙述，正确的是（

）

A．精卵相互识别的基础是细胞膜的流动性

B．后代从双亲各获得一半的DNA

C．使后代产生不同于双亲的基因组合

D．后代继承了双亲的全部遗传性状C第58页,共90页，2024年2月25日，星期天1、下列哪项正确的表达了牛胚胎的发育顺序A．配子→受精→合子→胚→卵裂B．合子→胚→胎儿→幼体→成体C．合子→卵裂→囊胚→原肠胚→胎儿D．精卵细胞形成→受精→合子→胎儿→出生2、哺乳动物受精卵在卵裂期发生的变化是A.细胞的总面积与总体积的比值逐渐增大B．细胞的数目增多，有机物含量大增C．每个细胞的DNA含量不断增加，全能性增高D．逐渐出现了原肠腔，并有了胚层的分化CA第59页,共90页，2024年2月25日，星期天下图表示蛙的受精卵发育至囊胚的过程中,DNA总量、每个细胞体积、所有细胞体积之和、有机物总量的变化趋势(横坐标为发育时间)。其中正确的是()A.①②B.①③C.②④D.③④A第60页,共90页，2024年2月25日，星期天一个新的小生命-受精卵诞生了第61页,共90页，2024年2月25日，星期天受精卵一边分裂，一边向子宫移动，到达子宫需7-8天。第62页,共90页，2024年2月25日，星期天受精后7天。胚芽完成"着陆",微微嵌入子宫内膜。此时它分裂发育为几百个细胞。第63页,共90页，2024年2月25日，星期天受精后的第三星期别看这小小的胚胎才2毫米长，但它却已具备发育成全身各个器官的原始结构：外、中、内三个胚层了第64页,共90页，2024年2月25日，星期天受精后6星期，与其说像人还不如说像鱼。6毫米长的小生命已经出现脑、脊柱、心脏和肝脏了。这时，胚胎的心跳每分钟140—150下，是母亲心跳的两倍。

第65页,共90页，2024年2月25日，星期天人类胚胎第8周时在子宫内的照片第66页,共90页，2024年2月25日，星期天第67页,共90页，2024年2月25日，星期天此时胎儿已长到20周，他移动手臂，把手指放在唇边，这可以促进它对吮吸的反映。第68页,共90页，2024年2月25日，星期天第69页,共90页，2024年2月25日，星期天第70页,共90页，2024年2月25日，星期天第71页,共90页，2024年2月25日，星期天体外受精胚胎体外培养胚胎移植胚胎分割胚胎干细胞培养第二节胚胎工程研究的重要内容：（技术手段）研究的对象：高等脊椎动物，特别是哺乳动物概念：通常指各种胚胎技术操作。第72页,共90页，2024年2月25日，星期天英国人W·希普于1890年在剑桥大学将纯种安哥拉兔的早期胚胎移植到一只已和同种交配的比利时兔的输卵管内。结果生出4只比利时兔和2只由胚胎发育而成的安哥拉兔。这是世界上第一例胚胎移植，胚胎移植技术由此创始。安哥拉兔比利时兔如何利用普通的比利时兔，快速地获得大量的具有性状优良的安哥拉兔呢？第73页,共90页，2024年2月25日，星期天选择供体母牛受体母牛……同期发情处理*……超数排卵*供体公牛配种取出早期胚胎质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）胚胎工程的过程未配种第74页,共90页，2024年2月25日，星期天一、体外受精和胚胎体外培养体外受精概念：采取雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使其在试管受精。过程：（1）精子的收集和获能；（2）卵母细胞的收集和培养；（3）获能精子和卵细胞的受精。第75页,共90页，2024年2月25日，星期天①精子的收集和获能1)收集:从附睾中取出成熟的精子2)获能处理:放入培养液中培养第76页,共90页，2024年2月25日，星期天超排卵技术利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵。第77页,共90页，2024年2月25日，星期天②卵母细胞的收集和培养1）卵巢进行超数排卵处理；

2）用超声监视器确定卵泡位置，插入穿刺针吸取卵泡液和卵母细胞，体外培养至成熟。第78页,共90页，2024年2月25日，星期天③受精

在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。第79页,共90页，2024年2月25日，星期天胚胎体外培养概念：将受精卵在人工环境下培养成早期胚胎。培养液：（不同时期成分不同）水、无机盐、有机物、维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及动物血清等。

胚胎培养比组织、细胞培养要难!

其他方式第80页,共90页，2024年2月25日，星期天二、胚胎移植胚胎移植概念:将经济价值较高、遗传性状优秀的母畜，经过激素处理，使其超数排卵后受精，然后将发育的早期胚胎分别移植到同期发情的代孕母的子宫内，通过代孕母妊娠产仔的技术。供体：提供胚胎的个体。