荧光PCR原理及应用

荧光PCR原理及应用

公司在首家通过国际ISO14001环境论证的深圳高新技术园区内拥有近2000m2的GMP标准生产厂房，其中包括严格按GMP要求建立的450m2的洁净车间及其他辅助车间，是目前国内第一家通过体外诊断试剂GMP认证的厂家。GMP标准厂房（GMP---药品生产质量管理规范）第2页,共55页，2024年2月25日，星期天产品概述第3页,共55页，2024年2月25日，星期天乙肝病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒人类免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒丙肝病毒(HCV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒结核杆菌(TB)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒沙眼衣原体和淋球菌(CT&NG)核酸扩增(PCR)荧光双检试剂盒已获得新药证书的产品第4页,共55页，2024年2月25日，星期天TORCH计划中的产品人巨细胞病毒(HCMV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒人乳头瘤病毒(HPV6/11;16/18)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒人单纯疱疹病毒(HSV)核酸扩增(PCR)荧光检试剂盒弓形虫(TOX.)核酸扩增(PCR)荧光检试剂盒风疹(RUB.)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒其他产品解脲支原体(UU)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒乙肝病毒(HBV)YMDD突变核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒待申报产品第5页,共55页，2024年2月25日，星期天幽门螺旋杆菌(HP)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒肺炎支原体(MP)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒EB病毒(EBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒梅毒(TP)核酸扩增(PCR)荧光检试剂盒

-地中海贫血(MA)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒苯丙酮尿症(PKU)核酸扩增(PCR)荧光检试剂盒开发研制中的新产品第6页,共55页，2024年2月25日，星期天新药试生产转

正式生产

批件

乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒

国药准字S20020033第7页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR基础第8页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR---DNA体外复制第9页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR——信号放大第10页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR的特点高灵敏度高特异性简便快捷第11页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR检测原理第12页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR？

荧光标记引物、探针或PCR扩增产物动态监测荧光信号变化第13页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光染料光能热能转移给临近的分子第14页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光信号荧光染料直接结合扩增产物SYBRgreenI——特异性结合双链，释放荧光信号荧光标记引物特异性荧光探针Taqman双荧光标记探针molecularBeacon荧光标记探针荧光标记杂交双探针第15页,共55页，2024年2月25日，星期天FRET？

当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。第16页,共55页，2024年2月25日，星期天Taqman？特异性荧光双标记探针Taq酶5’→3’外切酶活性第17页,共55页，2024年2月25日，星期天Molecularbeacon？第18页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光标记杂交双探针变性退火延伸第19页,共55页，2024年2月25日，星期天CT值—样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数第20页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR荧光试剂标准品扩增曲线（仪器：Bio-radiCycler）1x108拷贝/ml1x107拷贝/ml1x106拷贝/ml1x105拷贝/ml1x104拷贝/ml第21页,共55页，2024年2月25日，星期天定量原理和方法原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR扩增，绘制荧光定量标准曲线。内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。

第22页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR定量的原理-外标法第23页,共55页，2024年2月25日，星期天标准曲线→定量第24页,共55页，2024年2月25日，星期天对数期分析与终点分析的比较第25页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR重现性第26页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR特点灵敏度高特异性强全封闭PCR过程，无需后处理采用dUTP—UNG酶的防污染系统，有效降低污染机会即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品可实现一管多检仪器自动分析，更快获得结果第27页,共55页，2024年2月25日，星期天竞争性荧光内标(IC)定量PCR技术第28页,共55页，2024年2月25日，星期天竞争性荧光内标(IC)什么是IC?

Internalcontrol简称IC，通常是指与靶序列十分相似的一段DNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的不同荧光标记实现区分。IC的作用

监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因造成的定量误差进行修正。第29页,共55页，2024年2月25日，星期天内标工作原理图第30页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光PCR

在临床诊断上的应用第31页,共55页，2024年2月25日，星期天荧光定量PCR的临床应用早期诊断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证输血源的筛选母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断肿瘤的诊断第32页,共55页，2024年2月25日，星期天疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。第33页,共55页，2024年2月25日，星期天HBVDNA与血清免疫学的关系HBVDNA与HBsAg/HBsAb的关系

HBsAg（+）HBVDNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。

HBsAg（-）HBVDNA（+）：“窗口期”；HBsAg的水平过低无法检出，或者HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBVDNA阳性；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%，

HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBVDNA同时阳性，但通常HBVDNA检出率逐步下降HBVDNA与HBeAg/HBeAb的关系

HBeAg阳性与HBVDNA有显著相关。HBeAg阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。第34页,共55页，2024年2月25日，星期天病毒感染窗口期的NAT检测第35页,共55页，2024年2月25日，星期天Lametal-Hepatol26:226,1997对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。抗病毒药物疗效的观察、指导第36页,共55页，2024年2月25日，星期天如HBV：根据《2000年拉米夫定临床应用指导意见》，中国慢性乙肝病人治疗的主要目的就是降低血清HBVDNA，诱导HBeAg血清转换等。HIV:

目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒类药物，因此，HIVRNA滴度的定量测定与抗HIV药物治疗及疗效有着直接的关系。第37页,共55页，2024年2月25日，星期天乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的HBV滴度比较第38页,共55页，2024年2月25日，星期天新药验证

任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。第39页,共55页，2024年2月25日，星期天拉米夫定抑制血清HBVDNA0-20-40-60-80-100治疗周数拉米夫定安慰剂血清HBVDNA;中位%变化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期临床研究的综合数据第40页,共55页，2024年2月25日，星期天病情评估和预后判断

通过定量检测病毒滴度可以间接评估受侵器官或组织的炎症发生程度以及是否发生病变；长时间机体病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往预后不好。因此对病原体的定量PCR检测对病情和预后评估均有参考意义。第41页,共55页，2024年2月25日，星期天遗传疾病的早期诊断荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测。对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。第42页,共55页，2024年2月25日，星期天母婴传播的监控

荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。第43页,共55页，2024年2月25日，星期天肿瘤的诊断荧光PCR的作用：可对原癌基因的突变和易位等作出检测。可对原癌基因的mRNA进行定量分析。有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断。探索癌变发生机理的研究提供参考。区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。第44页,共55页，2024年2月25日，星期天结核病及性病等核酸检测意义病原体的检测在临床上通常采用镜检、培养等方法。镜检法操作简便，易造成假阳性结果，同时灵敏度较低。培养方法要求高，耗时，不利于临床上的及时诊断和用药。荧光PCR方法具高灵敏度，速度快。不能培养PCR是唯一确诊手段（例如HPV）第45页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR污染及预防对策

第46页,共55页，2024年2月25日，星期天污染原因

标本间交叉污染PCR试剂的污染PCR扩增产物污染气溶胶污染实验室中克隆质粒的污染第47页,共55页，2024年2月25日，星期天污染的监测

对照试验

试剂空白对照

阳性对照

阴性对照

重复性试验

第48页,共55页，2024年2月25日，星期天PCR防污染措施实验环境的控制

PCR应实行严格的分区操作：前准备区；样本处理区，其中DNA和RNA的处理也应该分开；扩增区。各区专区使用，并尽量使用一次性消耗品，高压消毒，实验器械和台面均应进行定期消毒等。2．避免PCR后处理

荧光PCR不同于其他的PCR方法，无须对PCR扩增产物进行任何的检测，实际就是对PCR污染的有力预防。3．dUTP防污染系统

反应体系中常规的dNTPS中的dTTP替换为dUTP，在扩增过程中dU取代dT的位置掺入到PCR产物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，发生U的糖苷键的水解，经高温处理后DNA链断裂成碎片，从而无法成为下一轮的PCR的模板。第49页,共55页，