酶联免疫吸附试验检测伤寒抗体方法的建立

酶联免疫吸附试验检测伤寒抗体方法的建立一、何为伤寒伤寒是由伤寒杆菌引起的急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但在目前的传染病防治中，仍占有重要的地位。我国的中医学书刊中所称的“伤寒”，指许多热性疾病，在中医学属于“湿温”病范畴，与现代医学的伤寒与副伤寒，具有不同的含义。伤寒是一种全身性的疾病，并非只局限于肠道受损。伤寒的基本病理特征是持续的菌血症与毒血症，单核吞噬细胞系统的增生性反应，以回肠下段淋巴组织为主的增生、肿胀、坏死与溃疡形成等病变为显著。第2页,共31页，2024年2月25日，星期天二、伤寒的检测伤寒是由伤寒杆菌引起的急性传染病，终年可发病，以夏秋季为多

。对沙门菌进行快速检测，及早发现传染源，切断传播途径，是最有效地防治沙门菌病的手段。一直以来，伤寒的实验室诊断方法主要靠细菌培养和肥达氏反应。前者的阳性率受病人应用抗生素的影响,而后者在病程的后期才出现阳性,且敏感性较低。这两种检测方法繁琐,需要时间较长,难以达到早期、快速诊断目的。为寻求敏感而特异的伤寒杆菌抗体检测法,我们建立了ELISA试验,检测伤寒病人血清中O抗体,我们采用购买的的伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，抽取家兔血，经分离与粗纯化，得到粗纯化的伤寒沙门菌O抗体，建立检测伤寒沙门氏菌O抗体的ELISA竞争法,并对伤寒沙门氏菌O抗体进行了检测。第3页,共31页，2024年2月25日，星期天三、ELISA实验原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接的放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。第4页,共31页，2024年2月25日，星期天第5页,共31页，2024年2月25日，星期天竞争法竞争法(ComperingELISA)可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于因相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：①将特异性抗体与固相载体联结形成固相抗体，洗涤、封板；②待测管中加受枪标本与一定量酶标抗原的混合溶液，使之与因相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。这样，受捡标本中抗原量越高，则由于这些抗原与固相抗体的结合，竞争性的占去了晦标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量越少。参考管中只加酶标抗原。孵育后，酶体抗原与固相抗体的结合可达最充分的量、洗涤。③加庇物显色。参考管中由于结合的酶标抗原量最多，故颜色最深。参考音颜色深度与待测管颜色深度之差．代表受检标本巾抗原的量。待测管颜色越淡．表示标本中抗原量越多。第6页,共31页，2024年2月25日，星期天第7页,共31页，2024年2月25日，星期天第8页,共31页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体材料与方法第9页,共31页，2024年2月25日，星期天第10页,共31页，2024年2月25日，星期天一、抗体的制备采用颗粒性抗原（伤寒O抗原）免疫家兔。周数日期操作第一周第一天（2015.9.7）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.1ml第二天（2015.9.8）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第三天（2015.9.9）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.2ml第四天（2015.9.10）耳缘静脉注射伤寒O菌液0.5ml第二周第一天（2015.9.14）两侧背部皮下注射伤寒O菌液各0.5ml第三周第一天（2015.9.21）耳缘静脉采血至少20ml第11页,共31页，2024年2月25日，星期天二、抗体的鉴定直接凝集试验3周后由已免疫兔的耳缘静脉采血0.5ml，37℃，2500r/min离心30min，取血清。取洁净试管10支，编号，将血清做1:10稀释。混匀后，37℃孵育2~4小时，观察结果。管号12345678910生理盐水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀释血清0.50.50.50.50.50.50.50.50.50伤寒菌液0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5终稀释浓度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120—弃第12页,共31页，2024年2月25日，星期天三、抗体的分离与纯化①取分离好的免疫血清一份（5ml），加入一份生理盐水（5ml）。②缓慢摇动，加入两份饱和硫酸铵溶液（10ml），室温静置1.5h。③2000r/min离心20min，吸弃上清。④用适量生理盐水（1~2ml）溶解沉淀，放置于透析袋中，透析24h。⑤收集，标记得到的伤寒沙门氏菌粗抗体，冰冻保存。第13页,共31页，2024年2月25日，星期天四、酶标抗体的制备——过碘酸钠法①取5mgHRP溶于0.5mlPH5.6HAC-NaAc缓冲液中，滴入NaIO4水溶液0.25ml，混匀，4℃作用30min。②再加入2.5%乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min。③然后加入待分离纯化的粗抗体1.5~2.0ml，用PH9.5的碳酸盐缓冲液调整反应液的PH至9.0左右，4℃过夜。④加入NaBH4溶液0.1ml，混匀，4℃作用2h，以PH7.4的PBS溶液溶解沉淀于透析袋中，4℃过夜。⑤次日收集。第14页,共31页，2024年2月25日，星期天五、ELISA预实验①包被抗原：伤寒抗原用包被液稀释，每孔加入0.1ml，37℃作用4h（或4℃作用24h）。②洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次30s，于吸水纸上充分拍干。③加入样品：每孔加入按倍数稀释好的酶标抗体及待测抗体各0.1ml，混匀，放入37℃恒温箱中孵育30min。④洗涤：弃去孔中液体，洗涤液洗涤3次，每次30s，于吸水纸上充分拍干。加入底物液：每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，观察颜色变化。第15页,共31页，2024年2月25日，星期天1:11:51:251:1251:251:501:1001:200待测Ab酶标AbELISA预实验第16页,共31页，2024年2月25日，星期天六、ELISA正式实验①包被抗原。②弃去ELISA板孔中的包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30s，在滤纸上拍干。③将各组原倍的待测血清与工作浓度的酶标抗体，分别加入各孔中，每孔各0.1ml，同时设定阴性对照，37℃孵育30min。④弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次30s，在滤纸上拍干。⑤加底物显色，每孔加入底物液A液1滴，B液1滴，避光放置5~15min，观察颜色变化。第17页,共31页，2024年2月25日，星期天第一组待测Ab第二组待测Ab第三组待测Ab第四组待测Ab阴性对照1:100待测Ab酶标AbELISA正式实验第18页,共31页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体实验结果第19页,共31页，2024年2月25日，星期天一、直接凝集实验结果21435678910实验结果肉眼观察在第7管无凝集，直接凝集实验粗略估计伤寒O抗体的效价为1：1280。第20页,共31页，2024年2月25日，星期天二、酶标抗体的制备与鉴定用过碘酸钠法制备的酶标抗体经ELISA竞争法鉴定结果：阴阳色差最明显为第三排，即最佳工作浓度为1:100，与第五孔颜色相差最大的味待测抗体原倍浓度。1:251:501:1001:2001:11:51:251:125阴性第21页,共31页，2024年2月25日，星期天三、ELISA竞争法的目测结果ELISA竞争法目测实验结果：阴性对照孔出现蓝色；每组均与阴性对照孔有鲜明对比，抗体制备均良好。第二组颜色最浅，抗体效价最高。由于第三组无待测血清，故无第三组结果124对照对照421第22页,共31页，2024年2月25日，星期天酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体实验讨论及分析第23页,共31页，2024年2月25日，星期天一、ELISA实验过程中注意事项①实验前半小时从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。选取精确移液管，恒温孵育前振摇过程不可忽略。②操作过程应准确无误，实验中稀释液、酶标液、质控物、阴阳性对照和标本的加入量一定要准确，防止阳性对照和未知阳性标本的溅洒造成假阳性结果，以及感染操作人员。第24页,共31页，2024年2月25日，星期天③孵育温度和时间是夹心抗体（或抗原）形成、竞争结合反应的必要因素，因此要严格控制。一般来说，温度提高而抗原抗体结合的时间可缩短，否则时间延长，所以在试验前要选择最佳温度与时间。④洗涤时间洗板时应使洗液注满反应孔，调节洗板次数，保证洗板彻底。洗涤的干净程度直接影响结果。洗板是ELISA

检测的重要环节，应严格按说明书进行，达到洗涤次数和间隔时间要求，从而保证结果的准确度。第25页,共31页，2024年2月25日，星期天二、ELISA实验过程中的显色问题所有检测孔均无色：原因可能为酶结合物或底物失效、底物漏加（错加）、阳性对照漏加或错加，其中以酶结合物失效和底物错加为常见。查找原因的方法是将酶结合物与底物直接混合，观察有无显色；如显色则提示为阳性对照漏加或底物错加所致；若不显色，用新酶结合物与底物混合，观察有无显色；不显色则提示底物失效，显色提示原用酶结合物失效。所有检测孔均显色：原因多为洗板不净（孔内残留未结合的酶结合物）或显色时间过长。第26页,共31页，2024年2月25日，星期天三、ELISA法与肥达氏反应法对诊断伤寒的比较分析

肥达氏诊断伤寒为经典血清学检验主要检测血清中抗体，从感染到血中产生抗体要有一定时间，而且操作繁琐，结果慢（过夜观察）。伤寒杆菌抗原酶免ELISA其包被和酶标记抗体均针对伤寒杆菌的单克隆抗体直接检测血清中抗原特异性强、快速、操作简便、从加样到判读实验结果仅需45min。两法通过χ2检验P<0.05，具有显著性差异，可作为早期快速辅助诊断伤寒的血清学方法。第27页,共31页，2024年2月25日，星期天近年来由于:①抗生素及皮质激素的使用有抑制抗体滴度作用。②有些患者感染较轻产生抗体较少。③患者体弱免疫反映弱缺乏丙种球蛋白不能产生抗体。少数患者肥达氏凝集效价始终不高，且肥达氏反应阳性反应出现较晚。单凭肥达氏反映诊断伤寒有其局限性，易出现漏诊，因此早期采用单克隆抗体检测血清中抗原帮助临床及早辅助诊断伤寒。第28页,共31页，2024年2月25日，星期天四、获得高效价的伤寒O抗体的原因分析①在抗体的制备过程中，免疫动物的选择，设计有效的免疫程序均可影响制备的抗体质量。