免疫组化技术课件

免疫组织化学技术

5/8/20241免疫组化技术课件

概念:

指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种免疫检测方法5/8/20242免疫组化技术课件基本原理

通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。5/8/20243免疫组化技术课件组织抗原抗体标记物

标记抗体1荧光2酶3亲和技术4金标5/8/20244免疫组化技术课件组织抗原

免疫细胞化学反应原理：＋标记抗体标记的抗原抗体复合物5/8/20245免疫组化技术课件间接法

直接法

两种免疫细胞化学反应方法5/8/20246免疫组化技术课件组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法应用5/8/20247免疫组化技术课件组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作5/8/20248免疫组化技术课件切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片5/8/20249免疫组化技术课件目的:使细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。组织材料的固定5/8/202410免疫组化技术课件影响固定的因素1.温度一般固定液固定效果随温度升高而加强，以室温22℃

为常用。2．浓度

10％中性甲醛，4％多聚甲醛固定液3.固定时间

要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。组织固定后，必须彻底冲洗以去除固定液5/8/202411免疫组化技术课件组织的脱水脱水就是用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程。不同的组织应分开脱水，特别是对一些易脆的组织（肝、脾等）应严格掌握脱水时间。动物组织的脱水时间应比人体相应标本时间短脱水应按照从低浓度到高浓度的过程。5/8/202412免疫组化技术课件组织的透明、浸蜡、包埋组织透明的目的是便于浸腊包埋组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够。最常用的透明剂为二甲苯浸蜡包埋是使蜡进入到组织中使其变硬便于切片。蜡的熔点一般为56-58

℃。包埋蜡的温度应与组织块温度接近。5/8/202413免疫组化技术课件大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％乙醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋5/8/202414免疫组化技术课件切片载玻片的清洁：

清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：

多聚赖氨酸（分子量200KD）：0.05%浓度，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥备用。

5/8/202415免疫组化技术课件切片：

石蜡切片：

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)60℃烤片3-8h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年

冰冻切片：

5/8/202416免疫组化技术课件细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。5/8/202417免疫组化技术课件细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。5/8/202418免疫组化技术课件抗原暴露和修复石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定剂甲醛使蛋白质发生凝固,在发生凝固的过程中可引起自身和不同蛋白质之间通过甲基化桥使蛋白质发生交联,导致蛋白质三级或四级结构的折叠方向发生改变,并形成网络状结构而掩盖抗原决定蔟。染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要抗原暴露和修复，可使抗原决定簇重新裸露。

抗原暴露和修复常用方法有二种,一是用酶消化,二是用热处理(微波辐射法、高压法及隔水加热法)5/8/202419免疫组化技术课件直接加热法

最常用,操作方法是将介质溶液用烧杯在电炉上加热至100℃,放入切片并保持95～100℃20min,在室温中自然冷却20min即可。热修复热介质0.01mol/LPH6.0柠檬酸缓冲液,最常用。5/8/202420免疫组化技术课件微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟。⑤待修复液自然降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

5/8/202421免疫组化技术课件高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液自然或冷水冲洗恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

5/8/202422免疫组化技术课件隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，边同容器一起放入水锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。

⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。

5/8/202423免疫组化技术课件胃蛋白酶消化法：

主要用于细胞间质抗原的检测,如纤维蛋白及各类胶原的现示。使用工作浓度为0.4％。配制方法:称取400mg胃蛋白酶加入到100ml0.01mol/LHCl中,组织切片在37℃消化30～60min。

5/8/202424免疫组化技术课件胰蛋白酶消化法：

最常用,主要用于细胞内抗原的检测。使用工作浓度为0.05～0.1％。配制方法:称取0.05g或0.1g胰蛋白酶及0.1g无水氯化钙,加入到100ml蒸溜水中,待溶解后用0.1mol/LNaOH调PH值至7.6。组织切片在37℃消化10～40min。

5/8/202425免疫组化技术课件蛋白酶K消化法主要用于原位杂交前标本的处理,常用的工作浓度为0.025mg/ml(25ug/ml)。配制方法:称取0.025mg蛋白酶K加入到1mlPK缓冲液中。(PK缓冲液:1mol/LPH8.0的Tris-Hcl10ml;0.5mol/LEDTA10ml;双蒸水80ml,三液充分混合即可)。5/8/202426免疫组化技术课件组织切片中内源性酶的阻断内源性过氧化物酶主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法：最常用0.3%~0.5%H2O2-甲醇液，作用15~30min，阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性（使特异性着色减弱），而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。5/8/202427免疫组化技术课件免疫染色标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法）免疫染色是免疫组化技术的关键步骤。5/8/202428免疫组化技术课件免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学5/8/202429免疫组化技术课件荧光标记免疫组织化学

直接法间接法5/8/202430免疫组化技术课件

免疫荧光技术将

荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位

免疫荧光技术5/8/202431免疫组化技术课件

１.异硫氰酸荧光素FITC

２.四乙基罗达明３.四甲基异硫氰酸罗达明４.藻红蛋白

▲呈现不同的荧光：绿色荧光(FITC)

橙色荧光

橙红色荧光

红色荧光等

荧光素

作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物5/8/202432免疫组化技术课件

荧光：

在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失

荧光显微镜：

荧光显微镜的光源提供各种激发光，如紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围），使受检标本内的荧光物质发出发射光5/8/202433免疫组化技术课件海马细胞

微管蛋白绿色(胞体、树突)

轴突终末蛋白红色(突触)5/8/202434免疫组化技术课件

培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色5/8/202435免疫组化技术课件免疫酶组织化学酶标记抗体法非标记抗体免疫酶法多聚螯合物酶法5/8/202436免疫组化技术课件酶标记抗体法是用结合物将酶标记（共价键或非共价键方法结合）在抗体分子上，通过抗原-抗体反应使抗原-抗体复合物上带有酶分子，再借助酶对底物的特异性催化作用，在抗原-抗体反应部位形成不溶性有色产物，在显微镜下观察组织中抗原的性质和分布。可用作标记抗体的酶有多种，但最常用的为辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AKP）其方法可分直接法和间接法两种。直接法直接法是将酶（如HRP）直接标记在特异性抗体上，然后与组织中的相应抗原相结合，形成抗原-抗体-HRP复合物，最后进行显色。5/8/202437免疫组化技术课件②间接法间接法也称夹心法，是将酶标记在第二抗体上（第二抗体为抗第一抗体的抗体），形成抗原-第一抗体-第二抗体-HRP复合物，然后进行显色。该法要求第二抗体与第一抗体应是不同种属的动物产物。间接法应用广泛，只需标记一种二抗就可以检测众多相同种属来源的一抗。5/8/202438免疫组化技术课件免疫组化SP法的基本步骤

（1）石蜡切片脱蜡至水。（2）抗原修复（3）3%H2O2室温孵育5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。（4）蒸馏水冲洗，PBS洗。（5）5%~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵育2h或4℃过夜。（6）PBS冲洗，5min×3次。（7）滴加适当比例稀释的二抗，37℃或室温孵育10~30min。（8）PBS冲洗，5min×3次。（9）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）或辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30min。（10）PBS冲洗，5min×3次。（11）显色剂显色（DAB或AEC）。（12）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树胶封片。5/8/202439免疫组化技术课件2、非标记抗体免疫酶法在酶标记抗体过程中可降低部分抗体和酶的活性，使得抗体的效价降低。另外，血清中的非特异性抗体也可被酶标记，引起非特异性背景。非标记抗体免疫酶法是先用酶（HRP或AKP）去免疫动物，使其产生抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如PAP（HRP）、APAAP（AKP）等复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键标记，保留了免疫活性，因此敏感性大大提高。非标记抗体免疫酶常用的有酶桥法，辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶复合物（peroxidaseantiperoxidasecomplexmethod,PAP）法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（APAAP）法。5/8/202440免疫组化技术课件3．多聚螯合物酶法该法是以高分子葡聚糖多聚化合物或氨基酸为骨架与抗体结合，将抗体（一抗或二抗）与HRP结合在一起，形成葡聚糖+HRP+抗体的巨大复合物，然后通过酶的底物进行显色。该法简便、敏感性高。其方法包括EPOS法（enhancedpolymerone-stepstaining）、EnVision法（又称为ELPS法enhancelabelledpolymersystem）、UIP法、PowerVision法。5/8/202441免疫组化技术课件EnVision法是通过葡聚糖将酶与二抗结合，形成酶-多聚化合物（葡聚糖）-第二抗体巨大复合物。每个复合物中含有约70个分子的HRP和10个分子的第二抗体。因复合物的HRP绝对数是远高于其他复合物，故具有高度的放大效果。流程为抗原+第一抗体+第二抗体（标记有葡聚糖合酶）→通过底物显色。5/8/202442免疫组化技术课件EnVision法步骤石蜡切片至水，PBS洗酶消化或热处理，作抗原修复3%H2O2甲醇液阻断内源性过氧化物酶10-20minPBS洗5min×3次滴加一抗37℃60min或4℃过夜PBS洗5min×3次滴加EnVision复合物30min(湿盒内室温或37℃)PBS洗5min×3次DAB显色水洗复染，常规封片5/8/202443免疫组化技术课件免疫组化结果的判断免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

5/8/202444免疫组化技术课件阳性反应的染色特征阳性反应染色分布有四种类型：细胞间质、胞浆、细胞核、细胞膜表面。

阳性细胞分布呈灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。5/8/202445免疫组化技术课件5/8/202446免疫组化技术课件5/8/202447免疫组化技术课件5/8/202448免疫组化技术课件注意事项一、抗体的保存

浓缩抗体：有效期内，只需放在4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4℃冰箱内可保存半年左右。

PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。5/8/202449免疫组化技术课件二、出现假阳性的原因

组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。5/8/202450免疫组化技术课件三、出现假阴性的原因

固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确。5/8/202451免疫组化技术课件四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。5/8/202452免疫组化技术课件免疫组织化学技术操作过程中的注意事项：新购置的抗体需做预实验，一是摸索一抗的最低工作浓度，如厂家提供的说明书上建议工作浓度为1：100，应设1：50，1：100，1：200进行预实验，二是观察一下该抗体的质量，是否有阳性表达，有些抗体在制作、运输、放置等过程中会使抗体效价减低或失活。免疫组织化学操作以手工为主，由于试剂（如缓冲液、显色液、封闭液等）时间、温度的不同会出现不同的结果（常见的为阳性强度、背景及衬染的深度）影响结果的分析。因此，每批实验标本应一次性操作完毕，否则会失去每组（实验组别）之间的可比性。从滴加一抗以后每个步骤切片均不能干涸，否则会出现假阳性或整张切片均呈阳性色。有些抗体，修复抗原时间不宜过度，否则会出现假阳性，如存在胞浆内的抗原在核内出现阳性表达，或定位于核内的蛋白会出现胞浆阳性，这种现象原因很多，抗体不纯也可能是一种原因，但也有一些可能目前还没有发现的原因。每次实验需设阳性对照和阴性对照，阳性对照是将明确含有所测抗原的切