抗体抗原分子识别的结构基础和功能研究

1项目名称： 抗体-抗原分子识别的结构基础和功能研究首席科学家： 郭亚军 中国人民解放军第二军医大学起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部门： 总后勤部卫生部 上海市科委2一、研究内容拟解决的关键科学问题包括： 1. 抗体研究平台的系统性抗体分子识别研究的一个重要条件是建立系统的、多层次和多角度的抗体研究平台。目前采用生物学方法结合原子层面的结构分析远远不能满足研究的需要。如何建立一个可针对多状态（静态与动态） 、多层次（原子分子细胞）和多角度（量子力学、牛顿力学和热力学）的系统研究平台是本项目拟解决的一个关键问题。我们采用结构生物学结合计算生物学和功能验证的策略，建立抗体“虚拟设计预测和验证”研究体系，发展和完善已建立的抗体研究生物技术平台。2、抗体抗原特异识别的可模拟性免疫识别和结合是发生在抗体分子与抗原分子特定位置、特定片段之间的互相匹配和吻合的过程。这种特异性相互作用是完全基于一级序列折叠后的三级结构，对应的蛋白质空间表面特征是揭示分子识别规律的基础。在已构建的抗体-抗原复合物库（平台）和前期 973 所建立的技术平台基础上，跨生物学、计算机、统计、数学等学科，引入地理信息系统（GIS）的“空间信息分析与模型分析”功能，对抗原抗体分子识别进行分析与模拟， 并结合其它子课题进行生物学试验验证。3. 抗体抗原分子相互作用的规律性分子识别必然存在着其普遍意义上的规律,在遗传密码之外还应该存在着“结构密码”,对分子识别规律的了解将能够大量获得特定功能的蛋白质。抗体分子的一系列重要生物学功能均与抗体分子特异性识别有紧密关系，对抗体分子识别规律的阐明，是本项目需要解决的重要关键科学问题。利用已建立的各种生物抗体库和抗体虚拟设计平台，通过抗体的虚拟设计抗体分子的结构，预测抗体功能，结合生物手段和生物信息技术，解析抗体分子的识别规律。对抗体分子识别规律的阐明也将为其它生物大分子识别规律的研究奠定理论基础。以我们已有的晶体结构明确的抗原表位为研究模型，在虚拟设计和生物验证的研究平台上采用从生物虚拟模拟生物的策略才有可能准确、全面地研究抗体分子识别的规律。3主要研究内容包括： 1利用地理信息系统（GIS）空间信息分析技术寻找抗体抗原表面结合位点识别规律:在生物信息大规模抗体虚拟库和抗体抗原分子识别的结构基础上，统计抗体抗原结合界面两侧的空间信息特征和特征，建立基于空间特征的蛋白质抗原空间表位预测方法，进行抗体抗原分子识别的分子动力学模拟，采用地理信息系统（GIS）的“空间信息分析与模型分析”功能,发展空间比对技术，寻找抗体抗原表面结合位点识别规律。2抗体抗原相互作用结构学基础：综合运用结构生物学、计算生物学、免疫学、分子生物学和生物化学的方法，以具有重要生物学功能的抗原和抗体分子为研究目标，构建抗原和抗体分子结构测定平台，抗原表位测定的技术平台，以及抗体生物学功能机制的分析平台。综合运用 X-射线晶体学、溶液核磁共振、冷冻电镜、X-射线小角散射等多种结构生物学手段测定抗体和抗原分子以及它们的复合物的在不同分辨率尺度上和不同测定方法基础上的三维结构信息，确定抗原分子上具有重要活性的功能表位，揭示抗体特异性高效识别靶标抗原的结构基础，阐明抗体发挥其生物学功能的分子机理。3. 抗体抗原复合物的分子分布特征及功能识别基础：利用近场光学显微术结合荧光量子点标记技术对单个抗原抗体在细胞表面的动态分布状态进行可视化研究及数量化分析，结合单分子力谱测量技术和原子力显微成像术对抗原抗体分子间结合，解离的动态过程给以精细探讨。进一步阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制，修正已建立的数学理论模型。4基于计算生物学的抗体分子设计及功能进化规律研究基于分子动力学（牛顿力学）和周期性边界条件下的密度泛函理论（量子4力学）探讨抗原-抗体相互作用的动态模式，建立基于结构的计算机虚拟突变技术并用于抗体分子的功能进化。利用 De novo 建模、微观组态相互作用理论获得抗体模拟多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗体分子功能进化规律，为新型抗体分子功能的预测提供理论依据。5、抗体分子识别的功能进化规律：利用现有的人源 Fab 抗体库和噬菌体抗体库技术与分子对接矩阵模式，结合人人单克隆抗体技术及小鼠杂交瘤技术，进行基于抗体表位的高通量抗体筛选；收集所产生的功能性抗体分子数据，建立充实“生物抗体数据库” ，结合结构生物学的数据和计算生物学手段对抗体分子识别特点进行研究，寻找抗体分子识别和发挥功能的规律。利用分子生物学、细胞生物学等方法对通过计算生物学获得的抗体分子进行克隆和表达，在细胞或动物模型上研究抗体分子的生物学功能，对抗体分子识别的作用规律进行系统研究。56二、预期目标总体目标： 以建立“抗体结构和功能”的创新研究体系、寻找抗体抗原分子识别的结构基础和作用规律为研究目标，本着“突出我国优势领域、着重解决符合重大需求的关键问题、瞄准国际基础理论前沿”的原则，在上一个 973 计划项目中所建立的生物信息学、生物大分子立体结构研究、数据挖掘技术以及抗体分子功能研究等技术平台上，建立抗体抗原相互作用规律研究的创新体系，探讨适用于功能性抗体分子发现的通用性规律，争取获得源头创新性研究成果，加快我国生物信息学、计算生物学、结构生物学和生物学的衔接和交叉，培养出一批高水平的各学科交叉型学术研究梯队。五年预期目标: 1建立抗体分子识别及作用规律的系统研究平台，开发并丰富生物信息学和计算生物学新算法，模拟抗体抗原相互作用进程，发现抗体分子识别及发挥作用的规律。2结合与交叉利用分子生物学，免疫学，结构生物学，计算机科学等众多相关领域的基础理论和技术，通过“表位预测与验证抗体分子模拟结构解析分子设计及预测生物功能验证”这一流程，建立抗原和抗体相互作用研究系统。3基于已建立的生物信息数据库，通过理论模拟和数理统计方法进行抗体分子设计及功能预测。采用地理空间信息分析系统和计算生物学等方法抽提推导抗体与抗原相互作用的规则或模式，从而虚拟设计出与抗原结合的抗体分子结构，推测其功能，并用可视化手段进行动态检测和验证。4对“虚拟设计”所得抗体分子采用生物技术实验手段进行克隆和表达，分析抗体分子与功能性抗原表位相互作用方式，在细胞和（或）动物模型上研究抗体分子的生物学功能，对抗体分子“虚拟设计预测体系”进行系统研究，找出抗体分子识别的通用性规律。5在 SCI 收录的学术期刊上发表论文 120 篇以上， 30 篇以上发表在相关7领域的国际权威刊物；取得具有国际影响的原创性学术成果 4-8 项，申报发明专利 20 项。8三、研究方案1学术思路： 本研究以阐明“抗体分子识别的结构基础与作用规律”为目标，采用地理空间信息分析技术平台和扫描探针/量子点标记技术，结合已拥有的抗体生物功能分析系统，组织计算生物学、结构生物学、功能基因组学、蛋白质组学和免疫学等优势力量，开展多学科综合性研究。力图通过对抗体分子识别机制与作用规律的发现，为快速寻找满足人们需要的特定功能的蛋白质（抗体）奠定理论基础。2技术途径： 本项目基于前一个 973 计划项目已建立的抗体虚拟筛选技术平台、晶体结构解析平台和高通量抗体功能验证平台，利用生物信息技术和生物抗体数据库，总结抗原抗体相互作用的表面分子特征，预测参与相互作用的关键位点，进行抗体分子模拟，采用多种结构生物学手段，在不同层面和角度解析抗原抗体复合物的结构，并在此基础上，利用计算生物学的技术途径进行分子设计及预测，最后通过生物、物理、化学等综合技术手段在细胞水平和动物模型中进行功能验证，寻找适用于功能性抗体分子识别和作用的通用性规律。3创新点与特色： 1）在前一个 973 计划项目研究的基础上，开创性地建立可针对多状态（静态与动态） 、多层次（原子分子细胞）和多角度（量子力学、牛顿力学和热力学）的抗体结构与功能系统研究平台。2）在已建立的“抗体生物信息库”的基础上，引入地理信息系统（GIS）的“空间信息分析与模型分析”功能，对抗原抗体分子识别结构进行分析与模拟，并对功能进行预测。3）采用结构生物学并结合计算生物学以及功能验证的策略，建立抗体“虚拟设计预测和验证”研究体系，利用 De novo 建模、微观组态相互作用理论获得抗体模拟多肽结构，设计全新功能性人源抗体分子及双功能多价抗体分子，在此基础上探讨抗体分子功能进化规律。94）利用近场光学显微术结合荧光量子点标记技术对单个抗原抗体在细胞表面的动态分布状态进行可视化研究及数量化分析，结合单分子力谱测量技术和原子力显微成像术对抗原抗体分子间结合，解离的动态过程给以精细探讨。阐明在生理条件下抗原抗体相互作用机制。5）本项目可为已立项的重大基础研究项目，如免疫学、蛋白质组学、肿瘤学、干细胞研究和国家新药创制重大专项等以及其他前沿技术领域提供有利的支持。4可行性分析： 1) 研究目标明确：在前一个 973 计划项目的支持下已建立的生物信息学、生物大分子立体结构研究、数据挖掘技术以及抗体分子功能研究等技术平台的基础上，建立拥有自主知识产权的抗体分子与功能研究的创新体系，找出适用于功能性抗体分子识别的通用性规律，并将研究成果推广到其它的生物大分子的研究中，争取获得源头创新性研究成果，加快我国生物信息学、计算生物学、免疫学、蛋白质组学和功能基因组学的衔接和交叉，培养出一批高水平的各学科交叉型学术研究梯队。2) 研究队伍：本项目的科研队伍主体均为来自国家及部门重点实验室的优秀中青年专家，团队成员包括国家杰出青年基金获得者、总后科技金星和新星、教育部新世纪创新人才、上海市“曙光计划”和“浦江计划”人才，还拥有教育部和上海市科技创新团队。项目组在计算生物学、机构生物学、生物信息学及抗体分子功能研究等领域积累了丰富的经验。3) 五年来在前一个 973 项目的支持下，在相关研究领域取得的工作基础与积累为协作攻关奠定了基础：建立了国际领先水平的抗体信息数据库和结构分析及大规模筛选的技术平台，尤其是利用抗原表位与抗体共结晶进行立体建模，并在此基础上利用计算机虚拟突变技术制备高亲和力功能性抗体分子。应用抗体抗原共结晶技术，在国际上首次解析了两种重要的单抗药物“Rituximab”和 “Efalizumab”的晶体结构，并比较了不同抗体亲和力差异的结构学基础；阐明了“Rituximab” 与 CD20、 “Efalizumab” 与CD11a 结合的结构与作用机制，文章分别发表于 JBC 和 PNAS。在此基础上，10设计表达了全新结构和高效功能的抗 CD20 四价抗体。文章发表于 Cancer Res.。以上成果为功能性抗体分子的研究提供了理论基础和新的技术方法。这些基础研究领域的突破为本项目的研究奠定了坚实的基础。4) 国家发改委、国家科技部和上海市科委也相继投入经费用于本项目相关基础设施的建设。本项目的研究单位均具有优良的研究条件，并在计算生物学、生物信息学、结构生物学及抗体分子研究领域积累了丰富的工作基础。在前一个 973 项目的基础上，国家发改委批准建立了“抗体药物国家工程研究中心” ，为本项目的顺利进行，提供了有力的技术及硬件设备上的支持。通过多方面协作攻关，形成了一支各学科配置合理，组织协调得力，攻关能力较强的科研队伍，为本项目的顺利实施奠定了基础。5、课题设置课题 1、基于生物信息学的抗原抗体分子识别与系统模拟预期目标：在已经建立的生物信息大规模抗体虚拟库和已知抗原信息的基础上， 解析抗体抗原分子识别的结构基础和特征，结合计算生物学、分子动力学技术， 引进地理信息系统（GIS）空间信息分析技术来扫描提炼抗体抗原表面结合位点识别规律，实现蛋白质抗原的空间表位预测以及抗体结合位点模拟预测。研究内容：1. 抗体抗原结合界面两侧的空间信息特征统计研究外界抗原千变万化，但是抗体在几个氨基酸上的变化就能特异性识别不同抗原，抗体识别抗原空间结构的策略具有重要科学意义。目前抗体-抗原的相互作用研究多集中于对抗体和抗原结合位点一级序列以及二级结构特征的提取，往往对蛋白质表面三维空间信息特征描述不够充分，影响进一步的抗体抗原相互作用本质研究。我们将跨学科收集所有可能的空间结构描述特征，在前期抗体结合界面的统计基础上，重点开展结合位点两侧的三维界面微环境分析，包括凸凹性，相邻性，构象性，结合片（patch）的化学和物理特征等，结合不同种属，不同抗原类别，与非免疫复合物相互作用界面的分析特征进行比较，得