分子生物学原理--基因工程

第十四章基因重组与基因工程Date 分子生物学原理基因重组 ： genomic recombination重组 DNA： recombinant DNADate 分子生物学原理第一节、自然界的基因重组 转化： transformation 整合： integration 转导： transduction 转位： transpositionDate 分子生物学原理转化 转化 ： 由外来DNA引起生物类型改变的过程称为转化。细菌的转化Date 分子生物学原理转化 病毒癌基因感染宿主细胞后，可整合到宿主染色体上，从而使宿主细胞癌变。转染： 噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。细胞的转化Date 分子生物学原理整合 整合： 噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。 此 DNA可 与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。 溶原菌： 整合了噬菌体基因组的细菌。 裂解： 噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并将细菌涨破。 Date 分子生物学原理整合 溶原和 裂解 可以相互转变。Date 分子生物学原理转导 溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，也可以 把邻近的宿主 DNA在切离时带走一部分。后者称 转导 。 带有宿主 DNA的噬菌体称 转导噬菌体 。 来源于宿主的基因称 转导基因 。Date 分子生物学原理转位 转位 ：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。 这些游动的基因称为 转位子 (transposon)。Date 分子生物学原理转位Date 分子生物学原理第二节、基因工程 基因工程 ：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体 DNA结合，成为重组DNA， 用以转化宿主，筛选出能表达重组 DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为 克隆 。也叫 基因克隆 或 重组DNA技术 。 分子水平上操作，细胞水平上表达。 赋予重组 DNA以新的生命力。Date 分子生物学原理基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实 GnT- 与转移有关。转入 GnT- 基因肝癌细胞株 SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义 GnT- 基因转移 转移 Date 分子生物学原理基因克隆分切接转筛Date 分子生物学原理载体和目的基因 载体 ： vector 在宿主细胞内可独立复制的完整 DNA分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。 常用的载体有： 质粒、 噬菌体 、 M13 噬菌体 逆转录病毒 DNA、 昆虫病毒 DNA 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。Date分子生物学原理质粒 质粒 ： plasmid 环形双链 DNA， 大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。 拷贝数 ：每个细菌能容纳的质粒数目。 质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。Date 分子生物学原理质粒 pBR322： 常用的质粒Date 分子生物学原理噬菌体载体 噬菌体 、 M13 噬菌体 易于感染大肠杆菌 噬菌体 DNA比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。 一个切口：插入型载体。 二个切口：置换型载体。Date 分子生物学原理噬菌体载体Date 分子生物学原理目的基因的来源 直接从染色体 DNA中分离：原核生物 人工合成：简单的多肽 从 mRNA合成 cDNA： 真核生物 基因文库： (gene library）G文库：用基因组的全部 DNA制备。c文库： 用细胞的全部 mRNA制备出全套cDNA后建库。Date 分子生物学原理从 mRNA合成 cDNADate 分子生物学原理限制性内切酶的应用 限制性内切酶可辨认 46个核苷酸：回文结构 回文结构 ： palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。 平端： blunt end 在同一水平上切断两条链。 (钝型末端 ) 粘性末端： sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。Date 分子生物学原理限制性内切酶的应用 Alu I .AGCT .AG CT.平端 TCGA .TC GA.BamH I GGATCC .G GATTC 粘性 .CCTAGG CCTAAG G 末端 Date 分子生物学原理限制性内切酶的应用切载体切目的基因限制性内切酶 相同粘性末端两者相连要点：避免切断目的基因Date 分子生物学原理载体和目的基因的连接 人工连接器 ： linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。 DNA连接酶 ：可用于连接碱基互补的二段核酸链。 连接方式： 粘端连接方式 尾接法Date 分子生物学原理粘端连接Date 分子生物学原理尾接法Date 分子生物学原理重组体的转化 基因的转移： 重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。 化学法： CaCl2转移法、碱金属离子转移法 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体Date 分子生物学原理重组体的转化转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。Date 分子生物学原理基因工程的表达体系的发展Date 分子生物学原理DNA重组体的筛选与鉴定 根据重组载体的表型进行筛选： 如质粒的抗药性、营养素的依赖型 DNA限制酶切图谱分析： 提取经粗选后的宿主 DNA， 用限制性内切酶切割后与原来载体比较。 利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主 DNA是否重组体。Date 分子生物学原理