抗菌药物筛选的实验方法与技术教案

* *综合化学实验 -化学生物学专题实验 指 导 教 师 ： 马 林，蔡小玲 化 学与 化 学 工程 学 院抗菌药物筛选的实验方法与技术 * *v 一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。v 体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。* *一、实验目的1，掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌、菌种培养、接种等微生物培养技术；2，掌握化合物抗菌、抑菌活性筛选技术；3，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小浓度测试等基本操作技术。4， 学会使用各种仪器设备 。实验中使用的仪器设备：1，手提式高压蒸汽灭菌锅；2，超净工作台；3，各种移液器；4，细菌恒温培养箱；5，微生物培养摇床；6，酶标仪；* *二、微生物培养基的配制、灭菌与培养培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的 pH。培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂 (常加 1.5%-2%的琼脂 )经融化冷凝而成。半固体培养这是指在液体培养基中加入 0.8 -1左右的琼脂，经融化冷凝而成。液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。 * *（一）基本原理v正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。v但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。 * *（二）实验过程1，液体及固体培养基的配制过程一般培养基的组成牛肉膏 0.5g蛋白胨 1gNaCl 0.5g琼脂 1.5-2g水 100mlpH 7.2 液体培养基不加琼脂即可。(1)称量及溶化 分别称取蛋白胨、NaCl、牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化。(2)调 pH 待溶液冷至室温时，用0.1mol/L NaOH溶液调 pH至 7.2。(3)定容 将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。(4)固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。(5)分装、加塞、包扎。(6)高压蒸汽灭菌 100 Pa灭菌 20 min* *2，培养基的分装液体培养基装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm 时，液体培养基可分装至试管高度 1/4左右为宜（约 5ml）；分装团体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中分装量为管高1/5(约 4-5ml)。* *3，棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 （ 1）试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。 将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成 捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。* *4， 培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。 （ 1）打开灭菌锅盖，加适量水；（ 2）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（ 3）将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密闭。（ 4）打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时 20 min后停止加热。（ 5）待压力降至接近 0时，慢慢打开放汽阀 (排汽口 )，开盖，立即取出灭菌物品。* *5，斜面和平板的制作 将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面 (图 1-3)斜面长度不超过试管长度 1/2为宜。* *平板的制作 * *6，斜面培养基接种 斜面培养基接种法一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖为菌种传代或观察其某些生化特性之用。 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉塞。* *7，液体培养基接种法* *三、微量稀释法体外抗菌实验v连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物的最小抑菌浓度（ MIC），即将微生物的浓度按几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。v微量稀释法 此种方法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应用 96孔微量稀释板，孔底呈 U型，每孔容量为 0.20-0.30ml。本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。* *(一）实验过程（ 1）实验菌的准备。选取大肠杆菌 (Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)、白色葡萄球菌 (Staphylococcus albus)、蜡状芽孢杆菌菌种在营养琼脂斜面培养基上传代培养一次后，再将其接种至营养肉汤培养基中 37 培养 6-12 h，冰箱备用。（ 2）抗菌化合物的初步筛选，按下表取 96孔培养板一块，进行编号，将 44种化合物（由有机化学研究所其他教师和研究生提供）用 DMSO或蒸馏水配制成50mol/ml，（也可用无菌过滤器过滤后）放置在灭菌的小离心管中。* *筛选实验过程（ 3）在超净工作台内，酒精灯下，将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为 1： 1000或1:500。用无菌的移液器（吸咀经过灭菌处理）将稀释的液体菌种198l加入到除了 A1,B1以外的孔内， 2l各种化合物溶液（ DMSO配置）， A1,B1,C1,D1加 200 l培养液，震荡混合后 37 培养 12h-18h, 用酶标仪 630nm侧吸光度。 DMSO的最终浓度保持在 1%。每个样品设两个平行孔。* *96孔细胞培养板加样安排1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 培养液 200l 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11B 培养液 200l 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11C 培养液 200l 样品 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22D 培养液 200l 样品 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22E 菌对照 (2l DMSO) 样品 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33F 菌对照 (2l DMSO) 样品 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33G 菌对照 (2l DMSO) 样品 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44H 菌对照 (2l DMSO) 样品 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44样品浓度 0.02mmol/ml 样品分子量 /100.mg 用 DMSO配成 0.5ml即可，每次实验用 2l， 96孔板的孔体积 200l，样品的最终浓度为 200mol/L，大于该浓度则无价值。* *试验用样品v 环丙沙星 v 2,4,3-三羟基二苯甲酮 v 2,4,4-三羟基二苯甲酮 v 2,4,2-三羟基二苯甲酮 v 2,3,4,2-四羟基二苯甲酮 v 2,3,4,3-四羟基二苯甲酮 v 2,3,4,4-四羟基二苯甲酮 v 2,4,2,4-四羟基二苯甲酮 v 2,3,4,2,4-五羟基二苯甲酮 v 丹皮酚 v 丹皮酚 -镍（ II）配合物 v 丹皮酚 -氧钒（ V）配合物 v 丹皮酚 -铜（ II）配合物 v 丹皮酚 -钴（ II）配合物 v 丹皮酚 -锰（ II）配合物 v 丹皮酚 -锌（ II）配合物 v 苯甲基 -N-苯基亚胺 v 3-羟基苯甲基 -N-苯基亚胺 v 4-羟基苯甲基 -N-2,4-二甲氧基苯基亚胺 v 2-羟基苯甲基 -N-3,5-二苯基亚胺 v 3,4-二羟基苯甲基 -N-苯基亚胺 v 4-羟基苯甲基 -N-3,4-二甲氧基苯基亚胺 23. 4-羟基 -3-甲氧基 -N-2,4-二甲氧基苯基亚胺24. 苯甲基 -N-4-羟基苯基亚胺 v 3,4-二羟基苯甲基 -N-2,4-二甲氧基苯基亚胺v 4-羟基苯甲基 -N-4-羟基苯基亚胺v 3,5-二羟基苯甲基 -N-3,4-二甲氧基苯基亚胺v 2,5-二羟基苯甲基 -N-4-羟基苯基亚胺 v 2,4-二羟基苯甲基 -N-4-羟基苯基亚胺 v 2,4-二羟基苯甲基 -N-2,4-二甲氧基苯基亚胺v 4-羟基苯甲基 -N-3-羟基苯基亚胺v 3,5-二羟基苯甲基 -N-2,4-二甲氧基苯基亚胺 v 4-羟基 -3-甲氧基 -N-3,4-二甲氧基苯基亚胺 v 4-羟基苯甲基 -N-4-甲基苯基亚胺 v 4-羟基 -3-甲氧基苯甲基 -N-4-甲基苯基亚胺 v 3,5-二羟基苯甲基 -N-4-甲基苯基亚胺 v 2,4-二羟基苯甲基 -N-4-甲基苯基亚胺 v 4-磺酸基 -3,4-二羟基偶氮苯v 4-磺酸基 -2,4-二羟基偶氮苯v 4-硝基 -3,4-二羟基偶氮苯v 4-硝基 -2,4-二羟基偶氮苯v 4-硝基 -2,5-二羟基偶氮苯v 4-溴 -3,4-二羟基偶氮苯 v 对羟基苯甲酸甲酯 * *筛选数据分析测试的样品中， 1号样为市场上临床使用的环丙沙星，浓度为 0.005mmol/L。其他样品浓度为0.02mmol/L。实验中，以培养基为空白 0%，以带菌培养液为对照 100%。如果酶标仪 630nm测试的结果中，空白为 -0.2，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为 +0.1-0.2。如果测试样品的值也同样达到 -0.2，表明样品在 200mol/L具有较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，请选取 11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。* *筛选数据分析测试的样品中， 1号样为市场上临床使用的环丙沙星，浓度为 0.005mmol/L。其他样品浓度为0.02mmol/L。实验中，以培养基为空白 0%，以带菌培养液为对照 100%。如果酶标仪 630nm测试的结果中，空白为 -0.2，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为 +0.1-0.2。如果测试样品的值也同样达到 -0.2，表明样品在 200mol/L具有较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，请选取 11个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。* *（ 4）最小抑菌浓度或 EC50的测试 v操作步骤与试管稀释法相似，一般常用 MH培养基，根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀后，置 37 温孵12-18h，用酶标仪 630nm侧吸光度。* *样品稀释后的浓度表A 培养液 200l 样品 1， 200M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11B 培养液 200l 样品 1， 100 MC 培养液 200l 样品 1， 50 MD 培养液 200l 样品 1， 25 ME 菌对照 (2l DMSO) 样品 1， 12.5 MF 菌对照 (2l DMSO) 样品 1， 6.25 MG 菌对照 (2l DMSO) 样品 1， 3.13 MH 菌对照 (2l DMSO) 样品 1， 1.56 M* *（二）数据处理与分析抗菌药物的最小抗菌浓度测试结果可能出现两种形式：1，在某一个稀释的样品浓度，结果表现出细菌没有生长，菌液较清（可与空白培养基比），而下一个稀释的样品浓度，菌液中细菌生长比较旺盛（可与含菌对照比），那么，这个稀释的样品浓度就为该样品抗菌的最小浓度。这种化合物的抗菌作用可以称为杀菌作用。如右表中红色值中的样品浓度就是最小抗菌浓度。培养液值 -0.2013 样品 1值 -0.2094 样品 2值 -0.2066培养液值 -0.2027 样品 1值 -0.2102 样品 2值 -0.2103培养液值 -0.2005 样品 1值 -0.2068 样品 2值 -0.2112培养液值 -0.2106 样品 1值 -0.2054 样品 2值 -0.2022菌对照值 0.2182 样品 1值 -0.2028 样品 2值 0.2087菌对照值 0.2068 样品 1值 -0.2008 样品 2值 0.2112菌对照值 0.2146 样品 1值 0.2023 样品 2值 0.2088菌对照值 0.2033 样品 1值 0.2036 样品 2值 0.2033* *2，实验中，不同稀释的样品浓度的测试结果没有上面的现象，而是出现规律性的上升。即，这种样品测出的数据是随着样品浓度的下降而上升，可以根据其数据画出一条细菌的生长曲线，如果对照样的值定为 100%，可以从曲线上求出抑制 50%时样品的浓度，所以，我们称这种 抗菌为抑菌作用，表明该化合物不能杀死细菌，但可以抑制其生长。培养液值 -0.2013 样品 1值 -0.2194 样品 2值 -0.2166培养液值 -0.2027 样品 1值 -0.2082 样品 2值 -0.1893培养液值 -0.2005 样品 1值 -0.1694 样品 2值 -0.1002培养液值 -0.2106 样品 1值 -0.1268 样品 2值 0.0022菌对照值 0.2182 样品 1值 -0.0428 样品 2值 0.0587菌对照值 0.2068 样品 1值 -0.0023 样品 2值 0.1612菌对照值 0.2146 样品 1值 0.6804 样品 2值 0.2088菌对照值 0.2033 样品 1值 0.1389 样品 2值 0.2133* *四、琼脂扩散法v 此种方法包括纸片法，杯碟法挖洞法等，它们的共同点均在平皿琼脂内加入适量测试细菌，按上述方法放置适量药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，细菌生长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了解细菌对药物的敏感程度。 v 琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一般是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌平板中，由于化合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的试验菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌圈或抑菌带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。* *图 :标准曲线法 图 ：链霉素标准曲线 双碟、钢管与抑菌圈位置图 S：标准品 T：供试品 抑菌圈直径 (mm)* *（一）滤纸片法实验过程（ 1）试验菌的准备。在营养培养基接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌种培养传代依次后，再移种至营养肉汤培养基中，在37 培养 10-18h，取出备用。（ 2）混菌平板的植被。用无菌吸管分别取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的肉汤培养物，在无菌平皿中各滴加 4-5滴，再将已溶化并冷却至 45 的琼脂培养基倒入平皿中，每皿 20mL，立即晃动平皿混匀，平放台上，凝固后备用。（ 3）用记号笔在无菌平皿底部划十字线，将平板分为四 -六个区，每一个区上标注加入药品名称。（ 4）用无菌镊子取无菌滤纸片（直径 6-8mm），浸入待测药液（可以稀释成 4-6不同浓度），然后轻轻放入混菌平板对应的区域中央，贴紧（如图）。（ 5）将平皿放入 37 恒温箱中倒置培养 20h，然后观察结果。（ 6）用卡尺测量抑菌圈的直径，以判断微生物的抑菌能力。* * *效果评价v抑菌圈直径 15mm 高度敏感v抑菌圈直径 10-15mm 中度敏感v抑菌圈直径 10mm 低度敏感v无抑菌圈 不敏感或耐药* *四、实验安排每周四上午，先进行抗菌药物的筛选，然后进行培养基的配制、灭菌，斜面和液体试管培养的制作及接菌，为第二天的实验做准备。每周五上午，用酶标仪进行抗菌药物的测定，然后进行最小浓度测试和琼脂扩散法测试实验。每周六上午 9时，用酶标仪检测最小抑菌浓度和抑菌圈测试。 由指导教师预先进行细菌试管液体培养 18-20小时，为后续实验做准备。123