血型鉴定与交叉合血

血型鉴定与交叉合血血型鉴定与交叉合血王炼红王炼红 解读解读 血型的定义及分类血型是指各种血液成分的遗传多态性标记。血型抗原不仅存在于红细胞上 ,也存在于白细胞和血小板上，还存在于各种组织细胞、多数体液中，甚至不同个体的血清蛋白间也存在型别的差异。血型系统主要分类：1.红细胞血型系统，其中又分为 ABO血型系统、Rh血型系统、 MNS血型系统、 P血型系统、 Kell血型系统、 Kidd血型系统、 Duffy血型系统2.人类主要组织相容性抗原系统（ HLA)3.血小板血型系统（ PHA）4.血清型。血清型按蛋白质可分为免疫球蛋白、血清酶、血清蛋白、补体等几大类。血型鉴定 血型鉴定主要用已知特异性的抗体鉴定未知的红细胞抗原，或辅助用已知抗原的一组红细胞（谱红细胞）鉴定未知血清的抗体，结合相关理论基础综合判断血型。血型鉴定以抗原、抗体免疫检测技术为基础，常用的方法有盐水介质法、微柱凝胶卡片法、聚凝胺法，疑难血型还可用聚合酶链反应（ PCR）技术直接分析相关血型的基因。1.1 ABO血型鉴定实验 原理： 根据红细胞上有或无 A抗原或 B抗原，将血型分为 A型、 B型、 AB型及 O型 4种。利用红细胞凝集试验，通过正、反定型准确鉴定 ABO血型。所谓正定型，是用已知抗 -A和抗 -B分型血清来测定红细胞上有无相应 A抗原或 /和 B抗原；所谓反定型，是用已知 A细胞和 B细胞来测定血清中有无相应的抗 -A或 /和抗 -B。试剂和材料 ： 1) 抗 -A(B型血 )、抗 -B(A型血 )及抗 -A+B(O型血）分型血清，购置商品试剂。 2) 5 A、 B及 O型试剂红细胞盐水悬液。 3) 受检者血清。 4) 受检者 5红细胞盐水悬液。ABO血型鉴定的检测方法1.试管法 （ 1）取洁净小试管（内径 10mm×60mm)3支，分别标明抗 -A、抗 -B 、抗 -A+B,用滴管分别加抗 -A、抗 -B 、抗 -A+B分型血清各 1滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者 5红细胞盐水悬液 1滴，混和。（ 2）另取洁净小试管（内径 10mm×60mm)3支，分别标明 A、 B、 O细胞 ,用滴管分别加入受检者血清 1滴于试管底部，再以滴管分别加入 5 A、 B、 O试剂红细胞盐水悬液 1滴，混和。（ 3) 立即以 1000r min离心 lmin.（ 4）将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以内眼观察有无凝集 (或溶血 )现象。如内眼不见凝集，应将反应物倒于玻片上，再以低倍镜检查。（ 5) 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于 A、 B亚型、类 B或 cisAB的发现。 4 红细胞凝集成一大块，血清清晰透明。 3 红细胞凝集成数小块，血清尚清晰。2 红细胞凝块分散成许多小块，见到游离红细 胞。1 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞 土 镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞 MF 混合凝集外观 (mixed field)是指镜下可见少 数红细胞凝集，而极大多数红细胞仍呈分散分布。 一 表示阴性，镜下未见凝集，红细胞均匀分布。 5) 凝集强度判断标准2.玻片法 （ 1) 取清洁玻片 1张 (或白瓷板 1块 )，用蜡笔划成方格，标明抗 -A、抗 -B、抗 A+B,分别用滴管滴加抗 -A、抗 -B、抗 -A+B分型血清 1滴于标明的方格内，再各加受检者 2红细胞悬液 1滴，混和。 （ 2) 另取洁净玻片一张 (或白瓷板 1块 )，用蜡笔划成方格，标明 A细胞、 B细胞和 O细胞，用滴管各加受检者血清 1滴，再分别用滴管滴加 A、 B和 O型试剂红细胞悬液 1滴。（ 3) 将玻片 (或白瓷板 )不断轻轻转动，使血清与红细胞充分混匀，连续约 15min，以肉眼观察有无凝集 (或溶血 )反应。玻片作试验时，也应用低倍镜观察结果。4） 结果判定 ABO血型正反定型结果 注释：十为凝集；一为不凝集。分型血清 +受检者 RBC 受检者血型 受检者血清 +试剂 RBC 抗 -A 抗 -B 抗 -A十 B A细胞 B细胞 O细胞十 十 A 十 十 十 B 十 一 O 十 十 十 十 十 AB 5）注意事项 （ 1）分型血清质量性能要符合要求，用毕后应放置冰箱保存，以免细菌污染。 （ 2） 试剂红细胞以 3个健康者同型新鲜红细胞混和，用生理盐水洗涤 3次，以去除存在于红细胞表面的血清中成分及可溶性抗原。 （ 3）试管、滴管和玻片必须清洁干燥，防止溶血。 （ 4） 操作方法应按规定，一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。 （ 5) 按理 IgM抗 -A和抗 -B与相应红细胞的反应温度以 4 为最强，但为了防止冷凝集现象的干扰，一般仍在室温 (20-24 )内进行试验， 37 可使反应减弱。 （ 6) 离心时间不宜过长或过短，速度不宜过快或过慢，以防假阳性或假阴性结果。（ 7) 观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别。 （ 8) 判断结果后应仔细核对、记录，避免笔误。 正反定型结果不一致的原因主要有以下三个方面：一、技术性方面问题二、红细胞方面的问题三、血清方面的问题常见情况如下：1) 分型血清效价太低、亲和力不强。若抗 -A血清效价不高，可将 A亚型误定为 O型， AB型误定为 B型。 2) 红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，误判为阴性反应。 3) 受检者红细胞上抗原位点过少 (如亚型、新生儿 )或抗原性减弱 (见于白血病或恶性肿瘤）以及类 B或 cisAB等。 4) 受检者血清中蛋白紊乱 (高球蛋白血症、高浓度的纤维蛋白原 )，或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列。 5) 受检者血清中缺乏应有的抗 -A或抗 -B抗体，如丙种球蛋白缺乏症。 6) 各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体 . 7) 由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集，往往是正反定型不符的原因。 8) 血清中有意外抗体，如自身抗 -I，常引起干扰。 9) 老年人血清中抗体水平大幅度下降。正反定型结果不一致的解决办法如发现 ABO正反定型结果不一致，先要重复做试验 1次。严格执行操作规程，使用质量合格的试剂以及细心观察和解释试验结果，就可解决明显的问题，对一些疑难问题必须进一步按以下步骤进行研究。 检查步骤 ：1) 另从受检者采取 l份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不符合。 2) 将红细胞洗涤数次，配成 5盐水细胞悬液，用抗 -A、抗 -B、抗 -A B、抗 -A1及抗 H做试验可以得到其它有用的信息。 3) 对受检红细胞作直接抗球蛋白试验 ,如结果呈阳性 ,表示红细胞已被抗体致敏。 4) 用 A1、 A2、 B、 O红细胞及自身红细胞检查受检血清。如果怀疑是抗 -I，用 O型 (或 ABO相合的 )脐血红细胞检查。 5)如果试验结果未见凝集，应将试验至少在室温和 4 放置 30min，用显微镜检查核实。 6) 若疑为 A抗原或 B抗原减弱，将受检红细胞与抗 -A或抗 -B血清作吸收及放散试验以及受检者唾液作A、 B、 H血型物质测定。后者只对 80%HAB分泌型的人有用。7) 若试验结果红细胞呈缗钱状排列，加等渗盐水 l滴，混和，往往可使缗钱现象消失。应注意，不要先加盐水 l滴于受检者血清中而后和红细胞作试验，以免使血清中抗体被稀释。 8）若受检者为 A型血而疑为有类 B抗原时，可用下列方法进行鉴别 ：（ 1）观察细胞与抗 -A及抗 -B的凝集强度，与抗 -A的反应要比与抗 -B的反应强。这种区别用玻片法作试验更为明显。（ 2）用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗 -B不凝集自身红细胞上的类 B抗原 。（ 3）检查唾液中是否有 A、 B物质，如果是分泌型，可检出 A物质而无 B物质 。 （ 4）核对患者的诊断，类 B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。 9) 如 发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的 Cad抗原活性；被细菌酶激活的 T或 TK受体；或产生机制不太明了的 Tn受体所引起。 多凝集红细胞具有以下特点： 能被人和许多家兔的血清凝集，不管有无相应的同种抗体。 不被脐带血清凝集。 通常不与自身的血清凝集。 原理： 用 5种抗 Rh分型血清抗 -C、抗 -c、抗 -D、抗 -E、抗 -e 来检测红细胞抗原 .在 Rh血型系统中 D抗原的抗原性最强，出现的频率最高 ,临床上影响最大，故临床上一般只鉴定 D抗原。常用抗 -D 血清来测定红细胞 ,凡带有 D抗原者，称为 Rh阳性，不带有 D抗原者，称为 Rh阴性。 试剂：抗 D血清 (购买商品试剂 )。 操作： 试管法：取 RhD(IgM)试剂 50uL和 5%受检者红细胞盐水悬液50uL，加入小试管内，摇匀， 900g离心 15秒，判定结果。同时做阴阳性对照。凝集 (或溶血 )反应为 Rh阳性 , 无凝集 (或溶血 )反应，仅表明实验的红细胞缺少正常强度的 D抗原，再用不同批号抗 D血清做重复试验，如无凝集 (或溶血 )反应，不能轻率地报告 Rh阴性，应做 Du鉴定。 1.2 Rh血型鉴定 注意事项：（ 1） Du 型人经输注 D阳性红细胞后可产生抗 D抗体，所以患者为 Du 型应作 Rh阴性论，应输注 Rh阴性血液 ;供血者为 Du 型，应作 Rh阳性论，不应当输给 Rh阴性患者。（ 2） Du 型妇女与 Rh阳性丈夫生育的婴儿可以产生新生儿溶血病。（ 3）本实验不适合于自身凝集的样本的检查，因自身凝集的样本容易引起假阳性。（ 4）对于检测为弱阳性和阴性的样本，应采用抗人球蛋白实验检测弱 D抗原或不完全 D抗原是否存在，同时做进一步的确认实验。交叉配血试验 交叉配血试验又称不配合性试验，是确保患者安全输血必不可少的试验，完整操作规程应包括：1.查阅受血者以前的血型检查记录（包括 Rh血型 )；2.对收到的受血者样本做 ABO正反定型和 Rh定型；3.选择合格的血液作交叉配血试验。 交叉配血的方法：（ 1）盐水介质配血法（ 2）酶介质配血法（ 3）抗人球蛋白配血法（ 4）凝聚胺介质配血法（ 5）微柱凝胶卡配血法 1.盐水介质配血法 标本处理 : 1) 抽取受血者静脉血 3-4ml, 待凝固后分离血清，并将红细胞配成 2%盐水悬液。2) 将供血者血样以同样方法分离血清，并将红细胞配成 2%盐水悬液。 操作1)取洁净小试管两支， 1支标明主侧（受血者血清供血者红细胞）；另 1支标明次侧（供血者血清受血者红细胞）。 2)按标记主侧管加受血者血清 1滴，加供血者红细胞悬液 1滴。次侧管加供血者血清 1滴，加受血者红细胞悬液 1滴，混匀，以 1000r/min离心 1min，轻轻侧动试管，观察结果。室温较低时，应将试管保温，以防冷凝集素引起的凝集反应。 结果判断及报告：1) ABO同型配血 ,主侧和次侧均无溶血及凝集表示无输血禁忌，可以输血。2) 两人值班时，交叉配血试验由两人互相核对；一人值班时，操作完毕后自已复核，并填写配血试验结果。 注意事项：1）受血者配血试验的血标本必须是输血前 3天之内的。 2) 血库要逐项核对输血申请单、受血者和供血者血样，复查受血者和供血者 ABO血型（正、反定型），并常规检查患者 Rh（ D）血型（急诊抢救患者紧急输血时 Rh(D)检查可除外），正确无误时才可进行交叉配血。 3) 凡输注全血、浓缩红细胞、红细胞悬液、洗涤红细胞、冰冻红细胞、浓缩白细胞、手工分离浓缩血小板等患者，应进行交叉配血试验。机器单采浓缩血小板应 ABO血型同型输注。 4) 凡遇有下列情况必须按 全国临床检验操作规程 有关规定作抗体筛选试验：交叉配血不合时；对有输血史、妊娠史或短期内需要接收多次输血者。2 改良离子交叉配血试验原理 红细胞表面带有大量的负电荷，当红细胞悬浮在电解质溶液中时，阳离子会被红细胞的负电荷所吸引，此时红细胞则被扩散的双层离子云所围绕而形成 Zeta电位， Zeta电位决定红细胞之间的相互排斥作用。凝聚胺技术首先利用低离子溶液降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞和血清（血浆）中的抗体结合。其后再加入凝聚胺溶液，它是一种高价阳离子多聚物，肝素中和剂，溶解后能产生很多正电荷，中和红细胞表面带有的负电荷，使红细胞 Zeta电位降低，缩短红细胞之间的距离，使红细胞产生非特异性的凝聚。最后加入悬浮液，具有中和凝聚胺阳离子的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，实验结果为阴性；但如果红细胞已被相应的抗体致敏，凝集就不会散开，实验结果为阳性。试剂组成 : R1 低离子介质溶液（ LIM），主要 成份（ 0.2%EDTA-Na2 ， 5%葡萄糖）R2 凝聚胺溶液（ Polybrene），主要成份（ 0.05%Polybrene ， 0.9 %氯化钠）R3 悬浮液（ Resuspending) ，主要成份（ 3.5%柠檬酸三钠， 1.5%葡萄糖）R4 阳性对照血清（含抗 D血清，氯化钠及稳定剂 )R5 抗人 IgG血清 试验步骤：1) 取试管二支，标主次侧，主侧管加病人血清（血浆） 2滴，加供血者 3%-5%红细胞悬液 1滴，次管反之。 2) 各加 LIM0.65mL，混合均匀后，再各加 Polybrene溶液 2滴，混合均匀。3）用离心机 3400转 /min离心 10秒，然后把上清液倒掉，让管底残留约 0.1mL的液体。4) 轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，若无凝集，实验无效，必须重做。5）最后加入悬浮液 2滴，轻轻摇动试管混合并同时观察结果。如果凝集在 60秒内散开，则是由 Polybrene引起的非特异性聚集，配合结果相合，如凝集不散开，则为红细胞抗原与抗体结合的特异性反应，配合结果不相合。观察凝集与否都需在显微镜下确认。