基因工程geneticengineering

基因克隆示意图 载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因宿主细胞重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达第1页/共83页第2页/共83页基因工程大事记 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 第3页/共83页 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第4页/共83页胰岛素 人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体第5页/共83页一，自然界的基因转移和重组 基因重组(genetic recombination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译 自然界的基因转移和重组是无目的 基因工程有目的第6页/共83页 结合作用 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌） 转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程第7页/共83页转导作用 transduction 病毒、噬菌体介导 溶菌途径；溶原菌途径裂解溶原第8页/共83页基因工程 工具酶 载体 重组DNA技术的基本过程 真核细胞转染 克隆基因的表达第9页/共83页工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3- 5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶：常用的工具酶：第10页/共83页一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)(Arber)、史密斯(Smith)(Smith)和内森斯(Nathans)(Nathans)，获19781978年诺贝尔生理学和医学奖第11页/共83页 1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。 细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。第12页/共83页第13页/共83页第14页/共83页 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。C-A-Pu-Py-T-GC-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-CG-T-Py-Pu-A-C55335533第15页/共83页限制性核酸内切酶(restriction enzyme) 识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键 分类：型、型、型 命名：EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)第16页/共83页 识别和切割位点 回文结构 46 bp 出现两种末端 粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点 同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端第17页/共83页粘性末端与平头末端EcoRGAATTCCTTAAG5533553355G GCTTAACTTAAAATTCAATTCG G333355粘性末端粘性末端SmaCCCGGGGGGCCC5533335555CCCCCCGGGGGGGGGGGGCCCCCC333355平头末端平头末端第18页/共83页修饰酶 DNA聚合酶 逆转录酶(reverse transcriptase) T4DNA连接酶(T4 ligase) 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) 末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)Taq DNA聚合酶第19页/共83页DNA聚合酶(pol )的活性 5至3的聚合活性 5 3方向 核酸 外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性 pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段 大片段 （Klenow片段）：聚合活性、 3 5外切活性 常用的工具酶第20页/共83页核酸外切酶活性 35外切酶活性 53外切酶活性53外切酶活性35外切酶活性5335第21页/共83页第22页/共83页第23页/共83页第24页/共83页末端脱氧核末端脱氧核苷酰转移酶苷酰转移酶(TDT)第25页/共83页载体 vector DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达 克隆载体、表达载体 原核载体：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（，M13）等 真核载体：动物病毒载体pLXSN等第26页/共83页第27页/共83页常用的克隆载体 质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)第28页/共83页 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )第29页/共83页第30页/共83页第31页/共83页第32页/共83页常用的克隆载体 噬菌体(phage) 基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区 DNA，替换型载体，外源DNA：923kb 常用：EMBL 系列、 gt 系列、charon系列 粘性质粒(cosmid)： DNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：4050kb M13噬菌体 最大优点：产生单链DNA第33页/共83页第34页/共83页第35页/共83页第36页/共83页第37页/共83页第38页/共83页第39页/共83页cos:cohesive-end site特点：特点：第40页/共83页第41页/共83页第42页/共83页RF DNA:replicational form DNA优点：优点：第43页/共83页表达载体(expressing vector) 特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列 大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号 启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子 核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列 转录终止序列第44页/共83页第45页/共83页第46页/共83页第47页/共83页哺乳动物表达载体 真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号第48页/共83页重组DNA技术的基本过程 目的基因的制备 载体的选择和制备 DNA分子的体外连接 将外源DNA导入宿主细胞 目的基因的筛选和鉴定第49页/共83页目的基因(target DNA)的制备 目的基因（外源基因） 制备基因组DNA - 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合 制备cDNA - cDNA文库(cDNA library) 制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成第50页/共83页第51页/共83页RNA模板杂化双链单链DNA双链DNA反转录酶RNaseH碱水解DNA聚合酶整合S1核酸酶细胞内复制试管内合成反转录酶反转录酶第52页/共83页第53页/共83页第54页/共83页第55页/共83页载体的选择和制备：噬菌体、粘性质粒、 pUC系列、M13噬菌体DNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高相同酶切末端平端连接 连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法第56页/共83页第57页/共83页第58页/共83页第59页/共83页第60页/共83页同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333第61页/共83页将外源DNA导入宿主细胞 基因工程菌 HB101,JM109 转化(transformation) 制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态 感染(infaction) 转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程 转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。第62页/共83页目的基因的筛选和鉴定(screening/selection) 遗传学方法 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 -互补 蓝白斑筛选 免疫学方法 分子杂交 探针 原位杂交 PCR 限制性酶切图谱 第63页/共83页第64页/共83页第65页/共83页第66页/共83页IPTG;X-gal(5- 溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷)第67页/共83页第68页/共83页 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 第69页/共83页第70页/共83页第71页/共83页克隆基因的表达 载体有转录、翻译的元件； 密码子通用原核表达体系 原核表达载体的标准 合适的筛选标志 强启动子 翻译控制序列 多克隆位点第72页/共83页融合蛋白（fusion protein,包涵体）表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白第73页/共83页第74页/共83页真核表达体系 转染方法 磷酸钙沉淀 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染；人造膜 显微注射 筛选标志 tk- Neor G418 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组第75页/共83页tk- 细胞突变株筛选转染细胞 胸苷激酶（tk） TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成 HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷） tk+：生长 tk-+带tk基因的质粒：生长第76页/共83页药物筛选转染细胞 neor 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成 G418：干扰原核、真核生物 neo：磷酸转移酶，使G418失活 neo 与目的基因连锁,转染第77页/共83页目的基因的定点诱变及其应用 基因定点诱变技术 基因定点诱变技术的应用第78页/共83页第79页/共83页第80页/共83页第81页/共83页第82页/共83页第83页/共83页 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。C-A-Pu-Py-T-GC-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-CG-T-Py-Pu-A-C55335533第15页/共83页 1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成 原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。 识别和切割序列：中心对称的回文结构。 限制性酶：Hind Nathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。C-A-Pu-Py-T-GC-A-Pu-Py-T-GG-T-Py-Pu-A-CG-T-Py-Pu-A-C55335533第15页/共83页第51页/共83页载体的选择和制备：噬菌体、粘性质粒、 pUC系列、M13噬菌体DNA分子的体外连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 连接效率高相同酶切末端平端连接 连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法第56页/共83页同聚物接尾法目的基因载体DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333第61页/共83页tk- 细胞突变株筛选转染细胞 胸苷激酶（tk） TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成 HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷） tk+：生长 tk-+带tk基因的质粒：生长第76页/共83页第80页/共83页