《核酸的结构与功能》PPT课件.ppt

第2章 核酸的结构与功能,Structure and Function of Nucleic Acid 高国全 2010-09-19,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,1868年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取核素。 1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质。 1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构。 1968年 Nirenberg发现遗传密码。 1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶。 1981年 Gilbert和Sanger建立DNA测序方法。 1985年 Mullis发明PCR技术。 1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)。 1994年 中国人类基因组计划启动。 2001年 美英等国完成人类基因组计划。,核酸研究的发展简史,核酸的分类及分布,存在于细胞核和线粒体,分布于细胞核、细胞质、线粒体,(deoxyribonucleic acid, DNA),(ribonucleic acid, RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,第一节 核酸的化学组成及其一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid,核酸组成,一、核苷酸是构成核酸的基本组成单位,碱基(base)是含氮的杂环化合物。,碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,尿嘧啶,胸腺嘧啶,胞嘧啶,存在于DNA和RNA中,仅存在于RNA中,仅存在于DNA中,碱基,嘌呤(purine，Pu),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),嘧啶(pyrimidine，Py),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),碱基的互变异构体,戊糖,脱氧核苷,嘌呤N-9 或嘧啶N-1与脱氧核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。,嘌呤N-9或嘧啶N-1与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)。,核苷,N,N,N,N,9,N,H,2,O,O,H,O,H,H,H,H,C,H,2,O,H,H,1,',2,',糖苷键,核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。,核苷酸(ribonucleotide),多磷酸核苷酸,环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信号转导中的第二信使。,cAMP,核苷酸衍生物,二、DNA是脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成的大分子,一个脱氧核苷酸3的羟基与另一个核苷酸5的-磷酸基团缩合形成磷酸二酯键(phosphodiester bond)。 多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷酸(polydeoxynucleotide)，即DNA链。,交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。,DNA链的方向是5 3,C,G,A,三、RNA也是具有3,5-磷酸二酯键的线性大分子,RNA也是多个核苷酸分子通过酯化反应形成的线性大分子，并且具有方向性；,RNA的戊糖是核糖； RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。,定义 核酸中核苷酸的共价连接和排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序,书写方法：,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,核酸分子的大小常用碱基(base或kilobase)数目来表示。 小的核酸片段(50bp)常被称为寡核苷酸(oligonucleotide)。自然界中的DNA和RNA的长度可以高达几十万个碱基。,DNA和RNA的区别,第二节 DNA的空间结构与功能Dimensional Structure and Function of DNA,DNA的空间结构又分为二级结构(secondary structure)和高级结构。,DNA的空间结构(spatial structure),构成DNA的所有原子在三维空间具有确定的相对位置关系。,一、DNA的二级结构是双螺旋结构,DNA stores genetic information The first direct evidence that DNA is the bearer of genetic information came in 1944 through a discovery made by Oswald T. Avery, Colin MacLeod, and Maclyn McCarty. A second important experiment provided inde- pendent evidence that DNA carries genetic information. In 1952 Alfred D. Hershey and Martha Chase used ra- dioactive phosphorus ( 32P) and radioactive sulfur ( 35S) tracers.,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,不同生物种属的DNA的碱基组成不同 同一个体的器官或组织的DNA碱基组成相同 A = T，G = C A+G = T+C,Chargaff rules（规则） An important clue to the structure of DNA came from the work of Erwin Chargaff and his colleagues,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,不同生物来源DNA碱基组分和相对比例,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,获得了高质量的DNA分子的X射线衍射照片 Rosalind Franklin and Maurice Wilkins used the powerful method of x-ray diffraction to analyze DNA fibers,（一）DNA双螺旋结构的研究背景,提出了DNA分子双螺旋结构(double helix)模型 In 1953 Watson and Crick postulated a three- dimensional model of DNA structure that accounted for all the available data.,两条多聚核苷酸链在空间的走向呈反向平行(anti-parallel)。两条链围绕着同一个螺旋轴形成右手螺旋(right-handed)的结构。双螺旋结构的直径为2.37nm，螺距为3.54nm。 脱氧核糖和磷酸基团组成的亲水性骨架位于双螺旋结构的外侧，疏水的碱基位于内侧。 双螺旋结构的表面形成了一个大沟(major groove)和一个小沟(minor groove)。,（二） DNA双螺旋结构模型要点,1.DNA是反向平行、右手螺旋的双链结构,亲水性的骨架位于双链的外侧。 疏水性的碱基位于双链的内侧。,骨架与碱基,2.DNA双链之间形成了互补碱基对,碱基配对关系称为互补碱基对(complementary base pair)。 DNA的两条链则互为互补链(complementary strand)。 碱基对平面与螺旋轴垂直。,碱基互补配对: 鸟嘌呤/胞嘧啶,碱基互补配对: 腺嘌呤/胸腺嘧啶,大沟与小沟,相邻两个碱基对会有重叠，产生了疏水性的碱基堆积力(base stacking interaction)。 碱基堆积力和互补碱基对的氢键共同维系着DNA结构的稳定。,3.疏水作用力和氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定。,碱基堆积作用力,（三）DNA双螺旋结构的多样性,三种DNA构型的比较,（四）DNA的多链螺旋结构,在酸性的溶液中，胞嘧啶的N-3原子被质子化，可与鸟嘌呤的N-7原子形成氢键；同时，胞嘧啶的N-4的氢原子也可与鸟嘌呤的O-6形成氢键，这种氢键被称为Hoogsteen氢键。,Hoogsteen氢键,Hoogsteen氢键，不破坏Watson-Crick氢键，由此形成了CGC的三链结构(triplex)。,三链结构,鸟嘌呤之间通过Hoogsteen氢键形成特殊的四链结构(tetraplex)。,四链结构,真核生物DNA3-末端是富含GT的多次重复序列，因而自身形成了折叠的四链结构。,二、DNA的高级结构是超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。,负超螺旋(negative supercoil) 盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。,（一）原核生物DNA的环状超螺旋结构,原核生物DNA多为环状，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。,DNA超螺旋结构的电镜图象,（二）真核生物DNA的高度有序和高度致密的结构,真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。 在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式存在，在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体(chromosome)。,DNA染色质呈现出的串珠样结构。 染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA染色质的电镜图像,DNA：约200bp 组蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,核小体的组成,核小体串珠样的结构,双链DNA的折叠和染色体组装,DNA经过多次折叠，被压缩了800010000倍，组装在直径只有为数微米的细胞核内。,真核生物的染色体,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,三、DNA是遗传信息的物质基础, Genes are segments of DNA that code for polypeptide chains and RNAs. Beadle and Tatum concluded that a gene is a segment of genetic material that determines or codes for one enzyme: the one gene-one enzyme hypothesis. Later this concept was broadened to one gene-one polypeptide. The modern biochemical definition of a gene is even more precise. A gene is all the DNA that encodes the primary sequence of some final gene product, which can be either a polypeptide or an RNA.,基因的概念,三、DNA是遗传信息的物质基础,第三节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,RNA与蛋白质共同负责基因的表达和表达过程的调控。 RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。 RNA比DNA分子量小。 RNA的种类、大小和结构远表现出多样性。,RNA的种类、分布、功能,信使RNA(messenger RNA, mRNA)是合成蛋白质的模板。 不均一核RNA(hnRNA)含有内含子(intron)和外显子(exon)。 外显子是氨基酸的编码序列，而内含子是非编码序列。 hnRNA经过剪切后成为成熟的mRNA。,一、mRNA是蛋白质合成中的模板,成熟的mRNA由氨基酸编码区和非编码区构成。 5-末端的帽子(cap)结构和3-末端的多聚A尾(poly-A tail)结构。 从AUG 开始，每三个核苷酸为一组编码了一个氨基酸，称为三联体密码(codon)。,成熟的真核生物mRNA,帽子结构:m7GpppNm,（一）大部分真核细胞mRNA的5'末端都以7-甲基鸟嘌呤-三磷酸核苷为起始结构,mRNA的帽结构可以与帽结合蛋白(cap binding protein，CBP)结合。,加帽过程,真核生物的mRNA 的3-末端转录后加上一段长短不一的聚腺苷酸（80-250A）。,（二）在真核生物mRNA的3'末端有多聚腺苷酸结构,加尾过程,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,内含子 (intron),外显子 (exon),（三）hnRNA的剪接,（三）mRNA加工成熟过程示意图,卵清蛋白mRNA的成熟,（四）mRNA是蛋白质合成的模板,从mRNA分子5'末端起的第一个AUG开始，每3个核苷酸为一组称为密码子(codon)或三联体密码(triplet code)。,AUG被称为起始密码子；决定肽链终止的密码子则称为终止密码子（UAA, UAG, UGA）。,位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame, ORF)，决定了多肽链的氨基酸序列 。,转运RNA (transfer RNA, tRNA)在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体, 将氨基酸转呈给mRNA。 由7495核苷酸组成； 占细胞总RNA的15%； 具有很好的稳定性。,二、tRNA是蛋白质合成中的氨基酸载体,（一）tRNA中含有多种稀有碱基,tRNA具有局部的茎环(stem-loop)结构或发卡(hairpin)结构。,（二）tRNA具有茎环结构,tRNA的二级结构 三叶草形,氨基酸臂 DHU环 反密码环 TC环 附加叉,tRNA的倒L三级结构,tRNA的3-末端都是以CCA结尾。 3-末端的A与氨基酸共价连结，tRNA成为了氨基酸的载体。 不同的tRNA可以结合不同的氨基酸。,（三）tRNA的3-末端连接氨基酸,tRNA的反密码子环上有一个由三个核苷酸构成的反密码子(anticodon)。 tRNA上的反密码子依照碱基互补的原则识别mRNA上的密码子。,（四）tRNA的反密码子识别mRNA的密码子,核蛋白体RNA (ribosomal RNA，rRNA)是细胞内含量最多的RNA(80)。 rRNA与核蛋白体蛋白结合组成核蛋白体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。,三、以rRNA为组分的核蛋白体是蛋白质合成的场所,核蛋白体的组成,大肠杆菌的核蛋白体,18S rRNA的二级结构,蛋白质合成时形成的复合体,RNA组学(RNomics)研究细胞内snmRNA的种类、结构和功能, 不同时空状态下snmRNAs表达谱的变化，以及与功能之间的关系。,四、snmRNA参与了基因表达的调控,细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,snmRNAs,核内小RNA snRNAs/snRNPs 核仁小RNA snoRNAs/snoRNPs 胞质小RNA scRNAs 催化性小RNA ribozyme/catalytic 小片段干涉 RNA siRNAs/RNAi 微小RNA miRNAs,snmRNAs的种类,核酶,某些小RNA分子具有催化特定RNA降解的活性，这种具有催化作用的小RNA亦被称为核酶(ribozyme)或催化性RNA(catalytic RNA)。,siRNA是生物宿主对外源侵入的基因表达的双链RNA进行切割所产生的特定长度和特定核酸序列的小片段RNA。 siRNA可以与外源基因表达的mRNA相结合，并诱发这些mRNA的降解。 基于此机理，人们发明了RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术。,小片段干扰RNA,noncoding RNA, single strand about 22 bases complementary to particular mRNAs cleaving mRNA or suppressing translation Some are encoded in the introns of other genes targeting to 1/3 human mRNAs and regulating gene expression,miRNAs,原核生物基因表达的特异性,五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现了不同的时空特性,真核生物基因表达的特异性,核酸的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第四节,核酸的酸碱及溶解度性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性。 核酸的高分子性质 粘度：DNARNA dsDNA ssDNA 沉降行为:不同构象的核酸分子的沉降的速率有很大差异，这是超速离心法提取和纯化核酸的理论基础。,核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。,一、核酸分子具有强烈的紫外吸收,碱基的紫外吸收光谱,DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相当于 50g/ml 双链DNA(dsDNA) 40g/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20g/ml 寡核苷酸 确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8 纯 RNA: A260/A280 = 2.0,紫外吸收的应用,二、DNA变性是双链解离为单链的过程,在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,定义,DNA变性 (denaturation)的本质是双链间氢键的断裂。,协同性的DNA解链,高温或极端的pH,DNA的变性,部分变性DNA的电镜图像,增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,DNA解链时的紫外吸收变化,DNA的解链曲线,连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。,解链温度(melting temperature，Tm),G+C 含量越高，解链温度就越高。,解链曲线的变化,三、变性的核酸可以复性或形成杂交双链,当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为DNA复性(renaturation) 。,减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸分子杂交,研究DNA分子中某一种基因的位置。 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。,核酸分子杂交的应用,第五节 核酸酶 Nuclease,依据底物不同分类 DNA酶(deoxyribonuclease, DNase)： 专一降解DNA。 RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。 依据切割部位不同 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非特异性限制性核酸内切酶。 核酸外切酶：5´3´或3´5´核酸外切酶。,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。,5,5,3,3,外切位点,外切位点,内切位点,内切位点,参与DNA的合成、修复以及RNA的剪接。 清除多余的、结构和功能异常的核酸，以及侵入细胞的外源性核酸。 降解食物中的核酸。 体外重组DNA技术中的重要工具酶 。,核酸酶的功能,