大鼠冠状病毒_涎泪腺炎病毒血清学检测方法建立及应用.doc

蒋虹涂新明吴小闲( 中国医学科学院 中国协和医科大学实验动物研究所 ,北京)摘要 以 RCV 为抗原 ,用 CF 、I EA 、EL ISA 三种方法检查 59 份大鼠血清标本 , I EA 、EL ISA 较CF 敏感 ,又 I EA 抗原制备简便经济 ,所以 I EA 为首选方法 。在应用 EL ISA 时 M HV 抗原可代替RCV 抗原检测 RCV 、SDAV 抗体 。关键词大鼠冠状病毒 ( RCV)大鼠涎泪腺炎病毒 ( SDAV)大鼠涎泪腺炎病毒和大鼠冠状病毒都属冠状病毒科 ,它们的形态和理化特性相同 ,抗原性一致 ,但致病性和组织亲嗜性不同 ,它们与小鼠鼠肝炎病毒有密切相关的抗原性1 3 。大鼠 涎泪腺炎病毒是高度触染性病毒 ,通过接触 、气溶胶或污染物在大鼠中传播 ,可导致大鼠涎泪 腺炎 。大鼠冠状病毒的感染在大鼠群中广泛存在 ,它引起新生大鼠肺炎 ,潜伏期短 ,传播快 ,死 亡率高 ,康复鼠表现为生长发育不良 ,在持续感染鼠群中表现为隐性感染 。涎泪腺炎病毒引起的损害可与营养缺乏 ,特别是维生素 A 缺乏所致的变化相混淆 ,动物实验中因气管分泌物过 多易引起动物在麻醉时死亡 ,还可干扰眼的研究 。涎泪腺炎病毒和大鼠冠状病毒均可促使其 他呼吸道感染加剧 。他们的血清学监测方法 ,我们采用了补体结合试验 ( CF) 、免疫酶染色法( I EA) 和酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) ,并进行了三种方法的特异性和敏感性的比较 。材料与方法1病毒毒种大鼠冠状病毒 ( RCV) 、涎泪腺炎病毒 ( SDAV) 毒种由美国 A TCC 提供 。2 抗原制备 I EA 抗原制备 将 RCV 、SDAV 分别接种大鼠肾细胞 ( R K) ,一天收毒涂 片 ,同时涂正常细胞作对照 。CF 和 EL ISA 抗原制备 将 RCV 、SDAV 分别接种 R K 细胞 ,2d 收毒 。小鼠鼠肝炎病毒 ( M HV) M HV - 1 、M HV - 3 、J HM 、A59 分别接种 DB T 细胞 ,24 h 收毒 。所收细胞液经超声波 粉碎 3 min ,低速离心 2000r mp / min 15 min ,超速离心 25000r mp / min 90 min ,取沉淀 ,用 p H916 包被液稀释为 10 倍浓缩抗原 ,分装低温保存 。同样方法制备正常抗原 。3免疫血清制备将 RCV 感染新生 SP F 大鼠 (腹腔注射 ip 、滴鼻感染 in) ,5d 后取肺 ,制成 20 %悬液离心取上清作为抗原 ,免疫 5 只 SP F 大鼠 ,ip 0 . 5 ml/ 只 ,免疫三次后颈动脉放血 ,即获得免疫血清 ,滴度 ( I EA) 可达 11601320 。4大鼠血清标本本所饲养场提供 ,新生大鼠 10 只 ,一周龄大鼠 10 只 ,成年大鼠 39 只 ,新生鼠腋下采血 ,用 015 %枸缘酸钠抗凝 。一周及成年大鼠眼眶取血 ,2000r mp / min 离心 ,取RCV 、SDAV 抗体 ,二抗用抗大鼠 Ig G 酶 150 。EL ISA 法用 RCV 、M HV 抗原检测大鼠血清抗体 。CF 法用 RCV 和多价 M HV 抗体 ,用微量法进行 。结果1病毒培养RCV 毒种接种大鼠肾细胞 ,三天后细胞无异常 ,再将细胞悬液离心取上清 ,接种三日龄大 鼠 ,滴鼻 (in) 0 . 01 ml/ 只 ,腹腔注射 (ip ) 0 . 1 ml/ 只 , 7d 后取肺作成组织悬液 , 再接种二日龄大 鼠 ,in 0 . 01 ml/ 只 ,ip 0 . 2 ml/ 只 ,24 h 开始发病死亡 ,解剖见肺部完全病变 ,将肺制成组织悬液离 心取上清 ,并接种 R K 细胞 ,三天后即获得高滴度病毒 。将 SDAV 毒种接种 R K 细胞 (需吸附 2 h) ,三天后待细胞出现融合时收获 。2CF 、I EA 和 EL ISA 方法比较表 1CF 、I EA 、EL ISA 三种方法敏感性比较 CF I EAEL ISA鼠 龄标本数阳性数( %)阳性标本平均滴度阳性数( %)阳性标本平均滴度阳性数( %)阳性标本平均 OD 值新生一周 成年 合计3 ( 30)10 ( 100)28 ( 7118)41 ( 6915)1121613215141135158 ( 80)10 ( 100)37 ( 9419)55 ( 9312)140139413581264186 ( 60)10 ( 100)39 ( 100)55 ( 9312)01391114019110103959三种方法均用 RCV 抗原 ,共检查大鼠血清标本 59 份 (正常抗原检测均为阴性) , CF 的阳性率 6915 % ,阳性标本平均滴度为 13515 。I EA 和 EL ISA 的阳性率为 9312 % , I EA 的阳性标 本平均滴度为 126418 。从 CF 与 I EA 和 EL ISA 的阳性率来看 , CF 的敏感性明显低于 I EA 和 EL ISA ,且 CF 的操作步骤较为复杂 ,不适于快速诊断 。I EA 和 EL ISA 的检出率较为接近 , 敏感性等同 ,又因 I EA 的抗原制备比较简便 ,而且经济 ( 细胞抗原用量少 ,不需要高速离心) , 所以采用 I EA 方法更为方便 。3RCV 和 SDAV 抗原的比较表 2RCV 和 SDAV 抗原的比较SDAV 抗原RCV 抗原符合率阳性阴性阳性 14 ( 8715 %)阴性 2 ( 1215 %)合计 16 ( 100 %)12113 ( 81125 %)213 ( 18175 %)12/ 14 ( 8517 %)1/ 2 ( 50 %)用 I EA 方法检查 16 份大鼠血清标本 。以 RCV 为抗原 , 检出阳性数 14 , 阴性数 2 。以SDAV 为抗原 ,阳性数 13 ,阴性数 3 ,阳性符合率为 8517 % ,阴性符合率为 50 % 。RCV 抗原阳 性 SDAV 抗原阴性 2 份 ( 1413 %) , SDAV 抗原阳性 RCV 抗原阴性 1 份 ( 717 %) ,总符合率为81125 % 。结果表明两个抗原可以互用 。4RCV 和 M HV 抗原的比较M HV 与 RCV 、SDAV 同属于冠状病毒科 ,它们有相同的抗原成份 ,我们用 RCV 抗原和 M HV 抗原 , EL ISA 方法检查 35 份大鼠血清标本 ,两种抗原阳性检出率相同 ,都为 8816 % ,符 合率为 9413 % ,根据以上结果认为可以用 M HV 抗原代替 RCV 抗原来检测大鼠 RCV 、SDAVRCV 和 SDAV 在抗原性 、理化特性 、细胞培养等方面很相似 ,很难从病毒学和血清学上区分 ,但在比较血清抗体滴度时 ,它们都对各自的抗血清滴度高些 ,我们制备的 RCV 阳性血清(用 I EA 方法) 对 RCV 抗原的滴度要高于 SDAV 抗原 13 倍 。在实验动物感染实验中 ,两病 毒的临床表现有很大差别 , RCV 通常无症状 ,SDAV 则引起鼻炎及涎泪腺炎 ,但有许多体征很 难与霉形体 、仙台病毒 、病原性细菌等引起的体征区分 ,在大鼠急性感染后 ,补体结合抗体升高 可证实是否是 RCV 或 SDAV 感染 ,然而最敏感的测定抗体的实验是 I EA 和 EL ISA 方法 。介 于 M HV 与 RCV 和 SDAV 抗原的相关性 ,可用 M HV 抗原代替 RCV 和 SDAV 抗原进行血清 抗体检测 ,M HV 抗原具备制备简便 、来源容易等优点 ,适合常规监测 。参 考 文 献1 Gilles L ussier 编 1 涂新明译 1 中国实验动物学杂志 ,1992 ,2 ( 112) 752 Fuji WARA K. Y. et al . Exp . Anim. 1980 ,284193 MACHI I K. H. et al . Exp . Anim. 37251