天然药物化学电子教案第四章 色谱分离法

高等职业教育技能型人才培养培训工程系列教材,第四章 色谱分离法,知识目标：,掌握各种色谱分离技术的特点及适 用范围。 理解色谱分离方法的基本原理。 了解色谱分离方法的分类。,能力目标：,能够熟练使用氧化铝色谱法、硅胶色谱法、聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、薄层色谱法、纸色谱法的操作技术对天然药物提取液进行分离。 学会活性炭色谱法、凝胶色谱法、大孔吸附树脂法、电泳技术、干柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法的操作技术。,本 章 内 容,概 述,基本知识,同步测试,本章小结,色谱技术,如果天然药物的提取物中含有一些结构相似、性质相近的化学成分，用一般分离方法无法获得分离，那么，使用色谱分离法往往能获得较好的分离效果。色谱分离法具有试样用量少，分离效率高的特点，是目前被广泛应用的分离纯化和鉴定化合物的一种有效方法。具体应用时，可根据被分离化合物的性质和各种色谱分离法的特点，选择合适的色谱方法。,概 述,本章学习的色谱分离方法有氧化铝色谱法、硅胶色谱法、活性炭色谱法、聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、大孔吸附树脂法、凝胶色谱法、薄层色谱法、纸色谱法、电泳技术、干柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。,概 述,概 念,概 念,色谱分离法（Chromatography）是一种分离、纯化和鉴定化合物的现代理化分离分析方法。,（1）按色谱分离原理的不同可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、电泳技术等。,色谱分离法的分类,色谱法分类,（2）按操作方式的不同分类可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱和毛细管电泳色谱等。,（3）按固定相或支持剂种类的不同分类可分为氧化铝色谱、硅胶色谱、聚酰胺色谱、凝胶色谱等。,（4）按移动相种类的不同分类可分为气相色谱、液相色谱和超临界流体色谱等。,色谱分离法的基本原理,色谱法原理,利用混合物中各成分在固定相和移动相中吸附、分配及其亲和力的不同，当两相作相对运动时，这些成分在两相间进行反复多次的吸附或分配，从而得到分离。,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,利用作为固定相的吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离。,常用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,应用吸附色谱时，需全面考虑吸附剂、溶剂及被分离成分三者间相互联系又相互制约的关系，选择合适的条件，使达到分离的目的。,如果被分离物质的极性较大，可选用活度较低的吸附剂和极性较大的移动相；如果被分离物质的极性较小，可选用活度较高的吸附剂和极性较小的移动相。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,1吸附色谱的原理,常见一些化合物官能团的极性大小顺序如下：,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,2分配色谱的原理,利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数的不同而获得分离。两相溶剂中的一相需作为固定相，常以某种惰性固体吸住该相溶剂，使之固定，这种吸着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂（也称载体或担体）；另一相溶剂则作为移动相。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,3离子交换色谱的原理,利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质、或具有不同解离度的离子化合物得到分离。,色谱法原理,色谱分离法的基本原理,4凝胶色谱的原理,以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂作为移动相，随着移动相的流动，由于受凝胶颗粒中网孔半径的限制，被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部，而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻，只能通过凝胶颗粒外部的间隙，使混合物中分子量大小不同的化合物移动速率不同而得到分离。,色谱法原理,色谱分离方法的应用,色谱法应用,天然药物化学成分种类繁多，各有其特定的性质，可选择不同的色谱方法进行分离。一般而言，对于非极性成分常选用硅胶或氧化铝吸附色谱；对于极性较大的成分则选用分配色谱或弱吸附剂吸附色谱；对于酸性、碱性、两性成分可选用离子交换色谱，有时也可选用吸附色谱或分配色谱；对于分子量大小有差异的成分则可选用凝胶色谱。,色谱分离方法的应用,例如一般生物碱的分离用硅胶或氧化铝柱色谱，极性较大的生物碱则用分配色谱，季铵型水溶性生物碱可用分配色谱或离子交换色谱；皂苷、强心苷的分离可用分配色谱或硅胶吸附色谱；挥发油、甾体、萜类常首先选用硅胶及氧化铝色谱；黄酮类、鞣质等成分可用聚酰胺吸附色谱；有机酸、氨基酸可用离子交换色谱，有时也用分配色谱，或某些氨基酸类采用活性炭吸附色谱；而蛋白质、多肽、多糖等大分子化合物则常用凝胶色谱。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,随着色谱理论的逐步发展，结合电子学、光学、计算机技术的发展和应用，色谱分离技术日趋仪器化、自动化和高速化，可快速分离复杂样品中的众多成分，现已逐渐成为一种重要的分离、分析工具，被广泛用于化工、医药、生化和环境保护等领域。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,随着色谱理论的逐步发展，结合电子学、光学、计算机技术的发展和应用，色谱分离技术日趋仪器化、自动化和高速化，可快速分离复杂样品中的众多成分，现已逐渐成为一种重要的分离、分析工具，被广泛用于化工、医药、生化和环境保护等领域。,色谱法应用,色谱分离方法的应用,【相关链接】 “色谱”的由来,20世纪初，俄国的波兰植物化学家茨维特（M.S.Tswett）在研究植物色素的过程中，首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同，分布不同，因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。到1907年，茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography，即中文的"色谱"，这就是现代“色谱”这一名词的来源。,色谱法应用,色 谱 技 术,氧化铝色谱法,硅胶色谱法,活性炭色谱法,聚酰胺色谱法,离子交换色谱法,大孔吸附树脂法,凝胶色谱法,薄层色谱法,纸色谱法,电泳技术,干柱色谱法,气相色谱法,高效液相色谱法,色谱技术,一、氧化铝色谱法,氧化铝是一种吸附力很强的亲水性吸附剂，有酸性、碱性、中性三种规格。其吸附活性与含水量有关，随着含水量的增加，吸附能力减弱。氧化铝的吸附能力大小，可根据含水量用不同的活度级别来表示（表4-1），通过活化或去活化的操作得到不同活度级别的氧化铝，一般在400左右加热6小时，即可得级的氧化铝。,是利用作为固定相的氧化铝对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,色谱技术,一、氧化铝色谱法,表4-1 硅胶、氧化铝活度与含水量关系,色谱技术,一、氧化铝色谱法,常采用柱色谱（column chromatography）的操作方法。柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中，以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱分离方法，也是色谱法最早出现的形式。具体操作如下：,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（1）色谱柱的选择：实验室常用的色谱柱的内径与柱长之比，常在110120之间。如图4-1所示的色谱柱装置。如果用于分离两种或两种以上性质相近的混合物，可选用细长的色谱柱；而需要从溶液中吸去某种成分或滤除不溶物及使用活性炭脱色时滤除细微的活性炭颗粒等，则可选用较粗矮的色谱柱。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,图4-1 柱色谱装置,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（2）装柱：装柱前先将空色谱柱清洗干净，干燥后，在色谱柱管底部铺一层脱脂棉，再加一层厚约0.5cm的石英砂，然后选择具体干法或湿法装柱。常选用湿法装柱，先往柱内加入少量的洗脱剂，然后将氧化铝与适量的洗脱剂混合均匀，不断搅拌排除气泡后，连续缓慢地倒入色谱柱内，打开色谱柱下端活塞，低速放出洗脱剂，使氧化铝慢慢沉降，注意继续补充洗脱液保持流速，确保液面高于氧化铝的表面，,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,同时轻轻敲打柱壁，至氧化铝沉降完全后，再使洗脱剂流动一段时间，算出柱内所含洗脱剂的体积，以便掌握收集流份的时间及在更换洗脱剂时，新换洗脱剂大致在何流份开始。保持洗脱液液面高出氧化铝表面一段距离，以防柱床干凅。装柱后，一般氧化铝的高度为色谱柱高度的3/4,要求柱中氧化铝充填均匀，柱体内不能出现空气泡、疏密不均或裂缝。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（3）上样：对于易溶于洗脱剂的试样，可用洗脱剂溶解试样制成高浓度试样溶液，放出色谱柱内洗脱液至液面略高于氧化铝表面，然后沿柱壁轻轻注入试样液，注意不要使氧化铝表面受搅动，打开活塞，使试样液缓缓渗入氧化铝柱内。对于难溶于洗脱剂的试样，则先将试样溶于适量甲醇、丙酮等低沸点的极性有机溶剂中，再用少量氧化铝拌匀，,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,在旋转蒸发器上小心蒸干溶剂或水浴挥干溶剂，置干燥器中吸除残留的溶剂和水分，然后将此吸着试样的氧化铝均匀地加在色谱柱中氧化铝的上面。加样后，要求试样层能够尽量窄且平整。最后，在上样后的氧化铝柱上面盖上一层约0.5cm厚的石英砂（或一层滤纸和玻璃珠层），使洗脱过程中柱体顶端保持平整。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（4）洗脱：洗脱剂的选用一般参照薄层色谱帮助确定的色谱条件，同时注意用梯度洗脱的方法，逐渐提高洗脱能力，使成分得到分离。洗脱的过程中应注意保持液面的高度，勿使柱面洗脱剂流干；控制洗脱剂的流速，一般不宜太快，若色谱柱长40cm，可控制流速为34ml/分钟，且保持匀速。洗脱液的收集根据具体分离情况而定，如果试样中各成分有色，分离过程中在柱上可观察到，则分别收集各色带；如果试样中各成分无色，常采用等份收集。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,根据所用氧化铝的量及试样分离的具体情况决定收集的每份洗脱液的体积。如所用氧化铝的量为50g，则每份收集的洗脱液为50ml；若试样各组分的结构相似或洗脱剂极性很大，则每份洗脱液收集量小。 洗脱后所得的各份洗脱液分别进行适当的浓缩，经薄层色谱检测后，合并相同流分，回收溶剂，获得单体。若为混合物，可进一步分离纯化。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（5）氧化铝的再生：柱色谱分离结束后，将柱内氧化铝倾出，用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤，再经高温活化后可重复使用。 亦可采用薄层色谱的操作方法，具体操作参照薄层色谱法。,操作步骤,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（1）氧化铝适用于碱性或中性的亲脂性成分的分离，如生物碱、甾体化合物、强心苷等，尤其是对生物碱的分离应用最多。具有分离效果好，再生容易，对杂质的吸附能力及分离试样的用量均优于硅胶等优点，但由于与某些酸性、酚性物质及色素等可发生异构化、氧化和消除反应等次级反应，故对醛、酮、酯、内酯等类型化合物的分离不宜采用。,操作提示,色谱技术,一、氧化铝色谱法,（2）柱色谱中氧化铝用前应过筛处理，使粒度均匀，常以100目左右大小为宜。（3）柱色谱中氧化铝的用量一般为样品量的2050倍，如果氧化铝对样品的吸附力较弱，则适当增加用量至100200倍。,操作提示,色谱技术,一、氧化铝色谱法,【相关链接】,1什么是活化？,在一定温度下加热除去吸附剂中的水分，使吸附剂吸附能力增强，活性增高的过程称为活化。,2什么是去活化？,在吸附剂中加入一定量的水分，使吸附剂吸附能力降低，活性减低的过程称为去活化。,色谱技术,一、氧化铝色谱法,【课堂活动】,模拟实验室氧化铝柱色谱操作，取一色谱柱和适量氧化铝，练习湿法装柱，叙述操作步骤及操作过程中的注意事项。,色谱技术,二、硅胶色谱法,是利用作为固定相的硅胶对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,硅胶是一种微呈酸性的多孔性物质。常用SiO2·xH2O表示，为硅氧烷交链结构：,色谱技术,二、硅胶色谱法,其骨架表面具有很多硅醇基，使硅胶能与许多化合物形成氢键而产生吸附作用。游离硅醇基数目的多少决定了硅胶吸附作用的强弱。硅醇基也容易通过氢键与水结合，随着含水量的增加，硅胶表面的游离硅醇基数目减少，硅胶吸附其他化合物的能力便随之减弱。硅胶的吸附能力大小可根据含水量，用不同的活度级别来表示（表4-1）。若含水量达17以上，硅胶的吸附能力极弱，不能用作吸附剂，可作为支持剂用于分配色谱。若将含水硅胶在100110温度下加热30分钟，能除去大部分硅醇基吸附的水，使硅胶恢复吸附能力。,色谱技术,二、硅胶色谱法,硅胶色谱分离的操作基本上与氧化铝相同。柱色谱中采用湿法装柱，且最好一次倾入。一般情况下，样品与硅胶的比例可为13060，若样品较难分离，可选用15001000。硅胶的再生一般可用甲醇或乙醇洗涤，挥干溶剂后活化即得；或用510倍体积的1氢氧化钠煮沸半小时，趁热滤过，蒸馏水洗3次，再以36倍5盐酸煮沸半小时，蒸馏水洗至中性，活化处理即可使用。,操作步骤,色谱技术,二、硅胶色谱法,硅胶亦可作为支持剂，吸着液体固定相后进行分配色谱操作。分配柱色谱是将吸着固定相的支持剂装入柱内，用适量固定相溶解试样后上样，然后以固定相饱和后的移动相进行洗脱，使试样中各组分因分配系数的不同而达到分离的方法。其装置与吸附柱色谱相同，具体操作如下：,操作步骤,色谱技术,二、硅胶色谱法,（1）装柱：将所选的固定相与支持剂以0.5111的用量比置于一定容器内，充分搅拌均匀使支持剂吸着固定相，多余的固定相则抽滤除去，然后倒入所用的移动相溶剂中，剧烈搅拌使移动相与固定相互相饱和平衡。装柱时先将固定相饱和后的移动相溶剂加入色谱柱内，再按湿法装柱操作装入吸着固定相的支持剂。,操作步骤,色谱技术,二、硅胶色谱法,（2）加样：在分配柱色谱中，一般支持剂的用量为试样量的1001000倍，其载样量较吸附柱色谱少。根据试样溶解性能的不同，有三种加样方法可供选择。对于易溶于固定相者，将试样溶于少量固定相后，加入少量支持剂拌匀，装入柱顶；对于可溶于移动相者，则直接溶于移动相溶剂后加入柱顶；对于在两相中均难溶者，则以使用的低沸点溶剂溶解后，加入干燥的支持剂拌匀，挥去溶剂，再用一定量的固定相拌匀，装入柱顶。,操作步骤,色谱技术,二、硅胶色谱法,（3）洗脱：洗脱所用的移动相均需先与固定相饱和。洗脱的方法与吸附柱色谱相同。,操作步骤,色谱技术,二、硅胶色谱法,（1）硅胶的活化不宜在较高温度下进行，当温度升至500时，硅胶失去吸附能力，再用水处理亦不能恢复其吸附活性。,（2）有时硅胶色谱具有吸附色谱和分配色谱的双重性质，甚至还有极弱的离子交换作用。,操作提示,色谱技术,二、硅胶色谱法,（3）硅胶作为一种酸性、亲水性的吸附剂，适用于中性或酸性成分的分离（包括非极性化合物和极性较小的化合物），如挥发油、黄酮、蒽醌、强心苷、皂苷、有机酸及酚性化合物、氨基酸等。具有吸附容量高，机械强度好，分离范围广等优点，应用最为广泛，但对碱性成分的分离不宜采用。,（4）在分配色谱中，常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素粉和滤纸等。,操作提示,色谱技术,二、硅胶色谱法,（5）以极性大的溶剂（如水或亲水性溶剂）为固定相，极性小的溶剂为移动相的分配色谱称为正相分配色谱，常用于分离极性较大的成分，如生物碱、糖类、苷类、有机酸等；而以极性小的溶剂（如氯仿、石油醚等亲脂性有机溶剂）为固定相，移动相溶剂却极性较大的分配色谱则称为反相分配色谱，常用于分离极性小的成分，如油脂、高级脂肪酸、游离甾体等。,操作提示,色谱技术,（6）选择适当的溶剂系统，可提高分离的效率。常用纸色谱摸索具体的分离条件，寻找合适的溶剂系统。,二、硅胶色谱法,操作提示,色谱技术,三、活性炭色谱法,是利用作为固定相的活性炭对混合物中各种成分吸附能力的大小不同，使各成分得到相互分离的方法。,活性炭是一种非极性吸附剂，具有较强的吸附能力， 其吸附能力受溶剂的影响，在水溶液中的吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。在一定条件下，对不同物质的吸附力也有差别。,色谱技术,一般对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。利用此性质，可使单糖与多糖分离，氨基酸与多肽分离，水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分离等等。实际应用时，应根据所分离物质的特性，选择吸附力适宜的活性炭。,三、活性炭色谱法,色谱技术,色谱用活性炭常分为三类：粉末状活性炭、颗粒状活性炭和锦纶活性炭。粉末状活性炭吸附力最强，但在色谱过程中流速极慢，需加压或减压操作；颗粒状活性炭在色谱过程中流速易于控制，故色谱分离最常选用；锦纶活性炭吸附力最弱，适于于分离用前两种活性炭不易洗脱的化合物。,三、活性炭色谱法,色谱技术,（1）装柱：先将少量蒸馏水加入色谱柱内，用玻璃纤维塞住底部，并除去气泡。然后用蒸馏水浸泡活性炭1小时，不断搅拌去除气泡，将处理后的活性炭倒入色谱柱中，使其自然沉降，装至所需体积后备用。,操作步骤,（2）上样：将试样溶于水，配成2550%的样品溶液后上样，一般每100毫升活性炭可上样510克。试样的上柱量和样品浓度可根据实际情况适当增加或减少。,三、活性炭色谱法,色谱技术,（3）洗脱：最常采用水，由稀至浓的乙醇水溶液梯度洗脱。最后可用适当有机溶剂或3.5%氨水将未洗脱部分洗脱下来。收集洗脱液，合并相似成分，浓缩后结晶。,操作步骤,三、活性炭色谱法,色谱技术,（1）此法适用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某些苷类等，具有试样上柱量大，分离效果好等特点，且活性炭价廉易得，适用于大量制备性分离。,（2）目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法，其吸附力不易控制，故活性炭的具体应用受到一定的限制。,三、活性炭色谱法,操作提示,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,聚酰胺（商品名又称为绵纶、尼龙）是由酰胺聚合而成的一类高分子化合物。色谱分离常用聚己内酰胺（绵纶6）和聚己二酰己二胺（绵纶66），其中聚己内酰胺可用结构式表示为：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,聚酰胺色谱法是利用作为固定相的聚酰胺分子内存在的许多酰胺基，能与酚类的羟基、酸类的羧基及醌类的醌基形成氢键而产生吸附（见图4-2），使混合物中各成分得到相互分离的方法。,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰胺对其吸附力的强弱。形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关，在水中最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。在聚酰胺柱色谱中常用作洗脱剂的各种溶剂洗脱能力顺序如下：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰胺对其吸附力的强弱。形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关，在水中最强，在有机溶剂中较弱，在碱性溶剂中最弱。在聚酰胺柱色谱中常用作洗脱剂的各种溶剂洗脱能力顺序如下：,水甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化钠液或稀氨溶液甲酰胺或二甲基甲酰胺尿素水溶液。,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,其次，与在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的影响有关，大致如下：,（1）化合物分子中能形成氢键的基团数目越多，被聚酰胺吸附越强。如：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（2）形成氢键的基团所处位置不同，被吸附的强度也不同。如：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（3）分子中芳香核、共轭双键越多，被吸附强度越大。如：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（4）化合物若能形成分子内氢键，则被吸附强度减小。如：,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（1）装柱：选用含水溶剂系统进行分离，通常以水装柱（操作同活性炭色谱）；选用非极性溶剂系统进行分离，则常以溶剂系统中极性低的组份装柱。,操作步骤,（2）上样：将试样溶于洗脱剂，配成2530%的样品溶液后上样，一般每100毫升聚酰胺可上样1.52.5克。试样的上柱量和样品浓度可根据实际情况适当增加或减少。若样品不溶于洗脱剂，可用甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等易挥发溶剂溶解，拌入干粉中，拌匀后将溶剂挥去，以洗脱剂浸泡装入柱中。,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（3）洗脱：最常采用水，由稀至浓的乙醇水溶液梯度洗脱；亦可用氯仿，氯仿-甲醇（191，101，51，21，11），甲醇依次洗脱。最后, 未洗脱部分可用或3.5%氨水洗脱下来。收集洗脱液，合并相似成分，浓缩后结晶。,操作步骤,（4）聚酰胺粉的回收：用5%氢氧化钠洗涤用过的聚酰胺粉至氢氧化钠颜色极淡即可。若因吸附了鞣质而难以洗脱，可在色谱柱中加入5%氢氧化钠浸泡，每天更换一次5%氢氧化钠，一周后可将鞣质基本清洗除去，接着用蒸馏水洗至pH 89，再用2倍量10%醋酸冲洗，最后蒸馏水洗至中性可重复使用。,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（1）如果选用氯仿装柱，为避免聚酰胺浮起，上样时需放出柱底端的氯仿层并立即上样，上样后顶端以棉花塞紧。,（2）聚酰胺色谱法常选用含水溶剂系统和非极性溶剂系统两类溶剂系统进行分离。含水溶剂系统适用于各种苷类、糖类、有机酸等水溶性成分的分离；非极性溶剂系统适用于萜类、甾体、黄酮体苷元、酚类、醌类等极性不太高的化合物的分离。,操作提示,色谱技术,四、聚酰胺色谱法,（3）此法常用于分离黄酮类、酚类、醌类等化合物，分离效果好。对鞣质的吸附因几不可逆，则常用于粗提物中鞣质的除去。此外，对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等成分的分离也有广泛的应用。因聚酰胺吸附容量大，故特别适合于化合物的制备性分离。,操作提示,色谱技术,五、离子交换色谱法,是利用离子交换树脂上的功能基能在水溶液中与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂作为固定相，使混合成分中离子型与非离子型化合物、或具有不同解离度的离子化合物得到分离的一种色谱方法。,色谱技术,五、离子交换色谱法,离子交换树脂是一类含有解离性功能基团的特殊高分子化合物，一般呈球状或无定形粒状。根据其解离性功能基团的不同，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类；在水溶液中，前者能通过-SO3H、-COOH或酚羟基中解离的H与溶液中的阳离子进行可逆性交换，后者能通过伯、仲、叔、季铵基中解离的OH与溶液中的阴离子进行可逆性交换。而其本身却不溶于水、酸、碱和有机溶剂。若以R代表离子交换树脂的母体，则其色谱分离的基本原理可表示为：,色谱技术,五、离子交换色谱法,阳离子交换树脂： RSO3H+ NaCl RSO3Na+ HCl 阴离子交换树脂： RNOH+ NaCl RNCl+ NaOH 具体选择离子交换树脂时，应综合考虑被分离物质所带电荷种类及其解离能力强弱、分子的大小与数量。,色谱技术,五、离子交换色谱法,（1）树脂的预处理：离子交换树脂在使用前，均需经过预处理，将所含的可溶性小分子有机物和铁、钙等杂质除去。根据分离试样中离子的性质，按酸碱酸的步骤用适当试剂处理阳离子交换树脂，按碱酸碱的步骤用适当试剂处理阴离子交换树脂，使树脂达到分离的要求。,操作步骤,色谱技术,五、离子交换色谱法,（2）装柱：装柱前先将树脂用蒸馏水充分溶胀，赶尽气泡，清洗至上层液透明，然后将溶胀后的树脂加少量水搅拌，连续倒入色谱柱（色谱柱要求耐酸、碱的腐蚀，柱长约为直径的1020倍）中，打开活塞，缓缓放出水液，使树脂均匀下沉。,操作步骤,色谱技术,五、离子交换色谱法,（3）上样：试样的用量由所选择的树脂的交换容量来决定。将试样溶于适当溶液中配成浓度较稀的试样液（对离子交换剂的选择性大，利于分离），按柱色谱的上样方法将试样液加入柱内，打开活塞，当试样溶液流经离子交换树脂时，溶液中的离子与树脂上的解离性基团进行交换，被吸附于树脂上，至试样溶液流出后，用蒸馏水冲洗树脂柱，将残液洗净。,操作步骤,色谱技术,五、离子交换色谱法,（4）洗脱：常用的洗脱剂有酸、碱、盐的水溶液或各种不同离子浓度的缓冲液等。对于不同类型的树脂，宜适当控制所选洗脱剂的pH值，并选择一种能解离出比被吸着的成分更活泼的离子或基团的洗脱剂，将吸着成分通过洗脱剂的洗脱而被替换下来。洗脱速度通常为12ml/min。洗脱液的收集与柱色谱相同。,操作步骤,（5）再生：由于离子交换树脂上的交换是可逆的，故对使用过的树脂可用与预处理相同的方法使其再生而恢复原状，再生后的树脂能反复使用。,色谱技术,五、离子交换色谱法,（1）离子交换树脂的选择：综合考虑被分离物质所带电荷种类及其解离能力强弱、分子的大小与数量具体选择。若被分离物质带正电荷（如生物碱盐或无机阳离子），选择阳离子交换树脂；若带负电荷（如有机酸或无机阴离子），则选择阴离子交换树脂。若被分离物质的解离能力强，酸碱性强，易与离子交换树脂进行可逆性交换，易被吸附，则选用弱酸型或弱碱型离子交换树脂，以免洗脱和再生困难；反之则选择强酸型或强碱型离子交换树脂。,操作提示,若被分离物质的分子量大，选择低交联度的树脂；若分子量小，则选择交联度大的树脂，以便使离子易于扩散与交换。,五、离子交换色谱法,（2）树脂的交换容量及颗粒的大小：通常均选用交换容量大的树脂。若用于一般的色谱分离，树脂粒度为200400目之间；若用于提取离子性成分，则树脂粒度应在100目左右；若用于制备去离子水，则粒度在1660目之间。,操作提示,色谱技术,（3）此法常用于分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合物，如生物碱、氨基酸、有机酸、酚类、肽类等天然药物化学成分。,五、离子交换色谱法,操作提示,色谱技术,五、离子交换色谱法,ISC2000型不需化学试剂的离子色谱仪（RFIC),色谱技术,五、离子交换色谱法,790-1型离子色谱仪离子色谱仪、英蓝技术 通用系列(常规分析及教学),色谱技术,是一种利用大孔吸附树脂具有的吸附性能及分子筛作用，使分子量的大小及吸附力的强弱不同的混合物中各成分获得分离的方法。,六、大孔吸附树脂法,大孔吸附树脂是一种化学结构与离子交换树脂类似却不含交换基团，具有大孔结构的有机高聚物吸附剂。形态多为白色球形颗粒，粒度通常为2060目，根据聚合材料的不同，可分为非极性、中极性和极性三大类型。,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,大孔吸附树脂的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物有较好的选择性，不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响。一方面，大孔吸附树脂通过范德华引力或形成氢键等分子间力吸附有机化合物；另一方面，其本身的多孔性网状结构决定了具有筛选性分离的特点。,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（1）大孔吸附树脂的预处理：常用的树脂有以下几种型号：D-101、DA-201、GDX-105、CAD-40、XAD-4、SIP系列及D-G型等。经过预处理，可除去新购树脂内部残余的致孔剂、引发剂、分散剂和一些未聚合的单体等。,操作步骤,（2）装柱和上样：选用合适的大孔吸附树脂，湿法装柱。装柱后，选择适宜的溶剂配制一定pH值的试样溶液，按湿法上样操作上样。注意所配试样溶液的浓度不宜过高，否则会使树脂的吸附量减少。,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（3）洗脱：常用的洗脱剂有水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯等。流速一般以控制在0.55ml/min为宜。根据实际情况，也可采用不同极性的洗脱剂进行梯度洗脱。洗脱液经检测后，合并相同组分。,操作步骤,（4）树脂柱的清洗：树脂使用后，其表面或内部会有许多非吸附性成分或吸附性杂质残留，必须经清洗以去除。,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（5）树脂的再生：使用过的树脂可经处理后再生。若选用了非水溶性的有机溶剂作为洗脱剂，用甲醇反复冲洗树脂柱即可；若选用了水溶性的洗脱剂，则用蒸馏水反复冲洗干净即可；若树脂经多次使用后，颜色加深，吸附能力下降，则可用3盐酸液或3氢氧化钠液依次浸泡12小时，再用蒸馏水洗至中性即可。树脂不用时，应浸泡于甲醇（或乙醇）中以湿态贮存，临用前用蒸馏水洗尽醇即可。,操作步骤,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（1）一般极性树脂用于吸附极性化合物，非极性树脂用于吸附非极性化合物。极性较大的成分适宜在中极性的树脂上进行分离，而极性小的成分则适宜在非极性树脂上进行分离；化合物分子体积较大者，宜选用较大孔径的树脂。,（2）湿法装柱，树脂装填高度小于3米。,（3）通常可在上样溶液中加入适量无机盐（如氯化钠、硫酸钠、硫酸铵等），以增大树脂的吸附量。,操作提示,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（4）对于非极性的树脂，洗脱剂的极性越小，其洗脱能力越强；对于中极性和极性树脂，则宜选用极性较大的洗脱剂。,（5）改变洗脱剂的pH值，可使某些被树脂吸附的成分形成较强的离子化合物，易被洗脱，提高洗脱效率。,操作提示,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,（6）大孔吸附树脂由于具有选择性好、能快速吸附且吸附容量大、机械强度高、再生容易等特点，已广泛应用于工业生产中（如废水的处理），也用于维生素、抗生素的分离提纯，并使水溶性天然药物化学成分的提纯得以大大简化，近年来多用于皂苷及其他苷类化合物的分离，获得较好的分离效果。,操作提示,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,大孔吸附树脂色谱法在天然药物化学成分分离的实际应用。,【相关链接】,据报道，向大雄等进行大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的研究，比较了三种大孔吸附树脂，发现AB型树脂的综合性能最好1。何琦等进行D140大孔吸附树脂银杏黄酮提取纯化性能研究，经12个周期反复使用，银杏黄酮产物收率3.54%，产物黄酮含量24.54%，确定D140大孔吸附树脂是一种综合性能较佳的银杏黄酮专用吸附树脂2。皮文霞等进行了大孔吸附树脂与活性炭富集山茱萸总苷的实验研究，发现大孔吸附树脂优于活性炭3。大孔吸附树脂分离技术具有广阔的应用前景。,色谱技术,六、大孔吸附树脂法,树脂柱吸附分离示意图,色谱技术,七、凝胶色谱法,凝胶色谱法是以凝胶作为固定相，选择适当的溶剂进行洗脱，使混合物中分子量大小不同的化合物得到分离的方法。,凝胶是具有多孔性网状结构的高分子化合物。选择合适的凝胶，是凝胶色谱法分离的关键。商品凝胶的种类很多，常用的有：,色谱技术,1.葡聚糖凝胶,又称为交联葡聚糖，是由葡聚糖和甘油通过醚桥（-OCH2CHOHCH2O-）相交链而成的多孔性网状结构物质，其部分结构如图4-3所示。具有亲水性，但不溶于水、稀酸、碱和盐溶液，能在水中溶胀成胶粒，在pH 310内稳定，适用于分离水溶性成分如蛋白质、肽、氨基酸、糖及苷类等，应用最为广泛。,七、凝胶色谱法,色谱技术,图4-3 交联葡聚糖的化学结构,七、凝胶色谱法,色谱技术,葡聚糖凝胶颗粒的网孔大小取决于制备时所添加交联剂的比例。若交联剂量多，则交联度大，网孔紧密，孔径小，吸水少；反之交联剂量少，则交联度小，网孔稀疏，孔径大，吸水多。商品型号按交联度大小分类，并以每克干凝胶吸水量10倍的数值来表示，如凝胶G-25型表示吸水量为2.5ml/g的葡聚糖凝胶。不同规格的葡聚糖凝胶适合用于分离不同分子量的化合物。,七、凝胶色谱法,色谱技术,2.葡聚糖凝胶LH-20,葡聚糖凝胶LH-20分子中引入了亲脂性基团，除了能在水中溶胀外，也能在许多有机溶剂如醇、甲酰胺、丙酮、氯仿等溶剂中溶胀（在醋酸乙酯、甲苯中溶胀不多），并在pH2的无氧化剂溶液中呈稳定状态。增大了应用范围，不仅可用于分离水溶性化合物，还可用于分离一些难溶于水或具一定程度亲脂性的化合物（如黄酮、蒽醌、香豆素等）。,七、凝胶色谱法,色谱技术,此外，还有聚丙烯酰胺凝胶（在pH 210内稳定，使用情况与葡聚糖凝胶相似），琼脂糖凝胶（适合于分离分子量在百万以上的特大分子化合物），以及结合了不同离子交换基团的葡聚糖凝胶衍生物等。,七、凝胶色谱法,色谱技术,受凝胶颗粒中网孔半径的限制，被分离试样中比网孔小的化合物可自由进入凝胶颗粒内部；而比网孔大的化合物不能进入凝胶颗粒内部被排阻，只能通过凝胶颗粒外部的间隙。随着移动相的流动，被分离试样中各成分的移动速率不同，大分子化合物阻力较小，流速较快，先被洗脱；而小分子化合物阻力较大，滞留在凝胶颗粒内部时间长，流速较慢，则后被洗脱，从而使试样中大小分子化合物获得分离。其机制见图4-4所示。,七、凝胶色谱法,色谱技术,七、凝胶色谱法,色谱技术,（1）装柱：装柱前，先要选择合适的凝胶种类、规格及粒度。一般情况下，若试样中各成分分子量悬殊较大，可使用100150目粒度较粗的颗粒；若试样为肽类和低分子量的物质进行脱盐处理，可采用G-10、G-15、G-25等凝胶，以G-25为好；若试样中各成分分子量较接近，可选用200目左右的粒度，且需适当处理以除去凝胶中的单体、粉末及碎片。采用湿法装柱。,操作步骤,七、凝胶色谱法,色谱技术,（2）上样：配制浓度适宜的试样溶液（体积要小），用滴管沿柱壁缓缓注入柱中，加完后将活塞打开，使试样完全渗入柱内，再关闭活塞。,操作步骤,七、凝胶色谱法,色谱技术,（3）洗脱：常选用水、酸、碱、盐和缓冲溶液等作为洗脱剂。对于固定相为葡聚糖凝胶LH-20的凝胶色谱，洗脱剂也可选用各种有机溶剂。适当控制洗脱的速度，若固定相颗粒细或交联度大，则流速可稍快。洗脱液分部收集，每一流份经检测后，合并相同组分。,操作步骤,（4）再生：当凝胶经多次使用后，通常在50左右用含2氢氧化钠和4氯化钠的混合液浸泡，再用水洗净，使其再生。,七、凝胶色谱法,色谱技术,（1）上样前，装好的色谱床至少要用3倍于色谱床体积的洗脱液平衡。,（2）试样上柱前要滤过或离心。,（3）用凝胶色谱收集得到的水溶液组份，若为对热不稳定物质，需进行冷冻干燥。,七、凝胶色谱法,操作提示,色谱技术,（4）此法具有设备简单、易于操作和所得结果准确等特点，现已发展成为天然药物化学和生物化学研究中一种常规的分离方法。主要用于天然药物化学成分中大小分子化合物（如蛋白质、酶、多肽、氨基酸、多糖、甾体、苷类及某些黄酮、生物碱等）的分离。,七、凝胶色谱法,操作提示,色谱技术,七、凝胶色谱法,羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱技术在天然药物化学成分分离的实际应用。,【相关链接】,实验研究发现，许多天然药物化学成分如黄酮类、生物碱、有机酸和香豆素等可用Sephadex LH-20提取分离。据报道，Hans Henke博士用Sephadex LH-20成功分离获得槲皮素、山奈酚和橙皮素4。Kamel H Shakker等采用Sephadex LH-20，以甲醇水（173）为流动相从Fagonia indica中分离得到三萜皂苷5。J.Labrana等采用Sephadex LH-20从Narcissus bujei 中成功分离石蒜碱和高石蒜碱6。,色谱技术,八、薄层色谱法,薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是一种将适宜的固定相均匀涂布于平面载板上成一薄层，欲分离的试样于薄层板上点样，随着展开剂的移行，混合物中各成分根据吸附性能或分配系数的不同而获得分离的方法。,色谱技术,常用于薄层色谱的固定相有氧化铝、硅胶、聚酰胺等吸附剂和硅藻土、纤维素等支持剂。因硅胶、氧化铝的吸附性能好，适用于多种化合物的分离，故又最为常用。,八、薄层色谱法,色谱技术,常见的商品规格有：硅胶H（不含粘合剂），硅胶G（含有1535石膏作为粘合剂），硅胶HF254（含在254nm波长紫外光下显荧光的无机荧光剂），硅胶HF254365（除含无机荧光剂外，还含有一种在365nm波长紫外光下显荧光的有机荧光剂，但此类荧光物质能被一些溶剂部分溶解），硅胶60HR（纯产品，供定量测定或光谱研究用），氧化铝G，碱性氧化铝H，碱性氧化铝HF254等。,八、薄层色谱法,色谱技术,根据具体情况的需要，可在吸附剂中加入稀酸或稀碱，或加入缓冲液，以改变吸附性能而达到分离的目的；还可制成特殊薄层，以提高分离效率，如分离糖类、醇类化合物或分离不饱和程度不同的化合物时，用硅胶氧化铝（11）为吸附剂或加入10硝酸银溶液制板。若硅胶、氧化铝均不适合时，可选用其他的吸附剂或改用分配色谱、离子交换色谱等。如聚酰胺薄膜，可用于分离极性和非极性物质，已广泛应用于天然药物化学成分的分离和鉴定。,八、薄层色谱法,色谱技术,薄层色谱所用的展开剂可根据被分离物质的溶解性、酸碱性、极性等性质及溶剂的极性，结合考虑所选吸附剂的吸附性能，选择单一溶剂或混合溶剂。,八、薄层色谱法,色谱技术,具体的操作步骤包括制板、点样、展开、显色和测定比移值五个部分：,操作步骤,（1）制板：用于制备薄层的载板可以选择玻璃板、塑料膜或铝箔，使用前先用适当的方法进行必要的处理，使必须达到载板表面光滑，清洁平整的要求。,八、薄层色谱法,色谱技术,制备的薄层板有软板和硬板两种。软板由吸附剂直接涂铺于载板上制成，因板上吸附剂易被吹散，现甚少使用。硬板则将吸附剂加粘合剂或溶剂调成糊状后涂铺载板制成，现使用较为普遍。如硅胶G板是由1g硅胶G加3ml水调成糊状涂铺载板制成，较脆，易脱落，但能耐受腐蚀性试剂；硅胶G-CMC-Na板是用1g硅胶G加3ml浓度0.51CMC-Na水溶液调成糊状涂铺载板制成，硬度较大，不易脱落，但若存在强腐蚀性试剂时则不宜加热。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,铺板的方法有倾注法、平铺法和机械涂铺法等。其中机械涂铺法是用涂铺器制板的方法，目前最为常用，可一次涂铺多块薄层板，所得薄层板分离效果好，适用于定量分析。,操作步骤,涂铺完成后的薄层板要求无气泡，厚度均匀（一般为0.250.5mm），需放置水平台面自然干燥后，在100105活化3060分钟，保存备用。也有一些薄层板不必加热活化，铺好阴干后即可使用。,八、薄层色谱法,色谱技术,分配薄层色谱制板方法与吸附薄层色谱有所不同。对于正相薄层色谱，若固定相为水，常可制备纤维素薄层板和硅藻土薄层板。前者将纤维素与水按15比例混匀后铺板，晾干即得，亦可在105烘干；后者将硅藻土G与蒸馏水按13比例混匀后铺板，阴干即得，使用前将薄层板面对沸水浴的蒸气，使吸收水分至饱和后，放置空气中让多余的水分蒸发完。若固定相为水以外的其他溶剂，则可用浸渍法、展开法及喷雾法将固定相涂布于铺有支持剂的薄层板上。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,对于反相薄层色谱，固定相常选用脂肪族碳氢化合物（尤其是癸烷到十四烷范围之间），可用510的正十一烷的石油醚液或1液体石蜡的乙醚溶液及5硅酮油的乙醚溶液进行涂布制板，挥去有机溶剂后即得。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,（2）点样：用合适的溶剂溶解试样，先配成浓度略高（约为5）的试样溶液，使用时再稀释到10.01的浓度。一般选择的溶剂应与展开剂极性相近或易于挥发，但需尽量避免选用水或甲醇。点样前在距离底边1.01.5cm处划一基线，用毛细管（定性分析）或微量注射器（定量分析）吸取试样溶液，于基线上点加试样，试样点直径应不大于23mm。除试样有特殊要求外，可用红外灯或吹风机在点样后加热除去原点残留的溶剂，以免对展开造成不良影响。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,（3）展开：薄层色谱展开需在密闭的色谱缸内进行，可根据薄层板的大小选择不同式样的色谱缸。展开的方式有上行、下行、近水平、环形、单向二次展开、双向或多次展开等，常用上行法。具体操作时，预先用展开剂将密闭的色谱缸饱和片刻，然后将点样后的薄层板置缸内支架上，勿与展开剂接触，预饱和一定时间，使与缸内饱和的展开剂气体达到平衡。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,饱和后，将薄层板点有试样的一端浸入展开剂中约0.5cm深处（注意勿使展开剂浸泡点样斑点），开始展开，随着展开剂的上升，试样中不同成分因迁移速度不同而得到分离。待展开剂上行迁移到规定高度（一般距基线约615cm）时取出，放置通风处，使展开剂自然挥干，或用热风吹干和用红外线快速干燥箱烘干即可。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,（4）显色：薄层色谱展开结束后，显色对于物质的鉴定十分重要。天然药物所含各种成分的显色条件各不相同，通常可先在日光下观察，标出色斑并确定其位置，然后在紫外光灯254nm或365nm波长紫外光下观察和标记，必要时再选择显色剂显色观察。若薄层板为硬板，则采用喷雾法将显色剂直接喷洒于板上，立即可显色或稍加热后显色；若为软板，如果不能采用喷雾法，则可选用碘蒸气法、压板法或侧吮法。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,（5）测定比移值：试样经色谱分离并显色后，分离所得物质在薄层色谱上的斑点位置可用比移值来表示。比移值Rf的计算公式如下：,操作步骤,Rf值原点至色谱斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离。,八、薄层色谱法,色谱技术,当需要分离微量混合物或天然化合物的降解产物时，则选择制备性薄层色谱。制备性薄层色谱的操作与上述的基本操作相似，不同之处在于：根据试样量决定所选薄层板的宽度和数目，薄层板的厚度要求增加至23mm；配制的试样溶液浓度增大，常为510；一般分离试样量在1050mg，随着试样量的增大可增加薄层板的块数；,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,为提高薄板的载样量，常将试样点成条状；色带的定位以采用紫外光灯检视为最好，如果必须采用显色剂显色，可先留出一条色带，薄板其余部分用另一玻璃板遮盖，显色并做好标记；试样需经洗脱操作（见图4-5），若为硬板，可直接刮取不同色带，分别洗脱，若为软板，则将色带分别吸入小色谱管中，再用适当的溶剂洗脱。经制备性薄层色谱分离，可获得毫克量的纯品。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,图4-5 制备薄层色谱法中收集色带操作,八、薄层色谱法,色谱技术,薄层色谱法具有价廉、设备简单、操作容易、展开迅速、所得斑点扩散小、分离过程受温度影响小、可使用腐蚀性显色剂、试样负荷量较大、分辨率高等优点，已广泛应用于分析化学、药物化学、染料、农药等领域，尤其是用于天然药物化学成分的分离鉴定、定量分析、微量制备等；还可配合柱色谱作跟踪分离，了解分离的效果，指导选择溶剂系统。但也存在一些不足之处，如比移值重现性差、易出现边缘现象、色谱图难保存等。近年来，随着薄层色谱技术的不断发展，出现了烧结薄层色谱法、高效薄层色谱法、有浓缩区的薄层色谱法、双波长薄层色谱扫描定量法等新技术，大大提高了分离的效能。,操作步骤,八、薄层色谱法,色谱技术,（1）根据被分离物质的性质，选择合适的吸附剂和展开剂是薄层色谱分离的关键。,（2）软板由于无黏合剂，只能用倾斜上行的展开方法。,（3）分离某些酸性或碱性成分，可在所选展开剂中加入少量的酸（如甲酸、醋酸）或碱（如氨水、二乙胺），或将一小杯挥发性酸或碱放置色谱缸内，以提高分离效率。,（4）在薄层色谱分离中能使各组分Rf值达到0.20.3的溶剂系统，可选为柱色谱的洗脱条件。,八、薄层色谱法,操作提示,色谱技术,CD60薄层色谱扫描仪,八、薄层色谱法,色谱技术,薄层色谱扫描仪,八、薄层色谱法,色谱技术,制备硅胶G-CMC-Na板，模拟实验室薄层色谱的操作。,用8g硅胶G加24ml浓度0.5CMC-Na水溶液，在乳钵中研磨均匀后，倒在一定大小的玻璃载板上，均匀涂铺，厚度约0.250.5mm，手轻轻振动玻璃板至表面均匀平整，室温放置晾干，用前活化。回答下列问题：,【课堂活动】,八、薄层色谱法,色谱技术,（1）怎样进行活化？,【课堂活动】,（2）薄层色谱的操作步骤如何？,（3）点样后预饱和还是预饱和后点样？,（4）如何计算斑点Rf值？,八、薄层色谱法,色谱技术,是一种以滤纸为支持剂，滤纸上吸着的水（或根据实际分离的需要，经适当处理后滤纸上吸附的溶液）为固定相，用一定的溶剂系统为移动相进行展开，而使试样中各组分达到分离的方法。,九、纸色谱法,色谱技术,（1）点样：纸色谱的点样方法与薄层色谱基本相似。点样量一般是几毫克至几十毫克，若点样量大，因试样在滤纸上先溶解再分配，则点样的原点也宜大些。,操作步骤,（2）展开：一般纸色谱展开的器具有纸色谱管、市售的色谱圆缸或具盖的标本瓶等。常用上行法展开。,九、纸色谱法,色谱技术,（3）显色：展开结束后，先在日光或紫外灯光下观察有无有色或荧光斑点，标记其位置，然后再根据所需检查成分喷洒相应的显色剂，显色后再定位。,操作步骤,（4）测定比移值：影响比移值的因素较多，一般采用在相同实验条件下与对照物质对比，以确定其异同。,九、纸色谱法,色谱技术,（1）通常定性用较薄的滤纸，较厚的滤纸供制备用。,（2）所用滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，必须不含影响色谱效果的杂质，也不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，必要时可作特殊处理后再用。,九、纸色谱法,操作提示,色谱技术,（3）点样不宜太集中。若与标准品对照，点样量最好大致相当。,（4）展开可选择上行、下行、径向、单向二次展开、双向或多次展开等。,九、纸色谱法,操作提示,色谱技术,用纸色谱法检识芸香苷。,取新华色谱滤纸条，用铅笔在距离纸底边12cm处画一直线，分别用毛细管点上1%芸香苷试样乙醇溶液和芸香苷标准品乙醇溶液，待溶剂挥干后，将纸垂直于色谱缸，下端浸入展开剂正丁醇-冰醋酸-水（411）中，上行法展开至展开剂前沿离起始线15cm时取出，画下前沿线，挥干展开剂后喷三氯化铝试剂显色，计算斑点Rf值。按照上述方法进行操作，叙述操作要点并回答下列问题：,【课堂活动】,九、纸色谱法,色谱技术,（1）点样后开始展开时，展开剂能否浸过起始线？,（2）如何计算斑点Rf值？,【课堂活动】,（3）纸色谱的分离原理属于哪一种？,九、纸色谱法,色谱技术,电泳技术是一种利用混合物中各成分所带电荷性质、电荷数量及分子质量的不同，一定的时间内，各成分在同一电场中泳动的方向和速度不同，使各自移动距离不同而获得分离的技术。影响电泳速度的因素包括分子所带的电荷、电场强度、溶液离子强度、电渗、缓冲液粘度及温度等。自从1937年考奈格（Konig）首创纸电泳技术后，电泳的种类和应用在广度和深度两方面均发展迅速，广泛应用于生物碱、有机酸、氨基酸、蛋白质、糖类等天然药物化学成分的分离和鉴定。,十、电泳技术,色谱技术,电泳系统的组成包括电源（电泳仪）、电泳槽、恒温装置和观察、成像装置等。常用的电泳技术有纸电泳、琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。,（一）纸电泳,是一种以纸作为带电质点溶液的支持物来进行电泳的分离方法。,十、电泳技术,色谱技术,（1）选择电泳装置：选用电压0800伏特，电流050毫安培的调压稳压整流器一台，电极用0.5毫米直径的铂金丝（或炭棒、不锈钢丝），用有机玻璃胶合制成的缓冲液槽或玻璃槽。,（2）选择缓冲液：常用1N氢氧化钠和醋酸-磷酸-硼酸各0.4M混合液配制成低离子强度缓冲液，利于控制电泳过程中电泳速度的恒定。,操作步骤,十、电泳技术,色谱技术,（3）点样：有湿点法和干点法两种方法。湿点法操作是将选择的滤纸全部浸入枸橼酸盐缓冲液（pH 3.0）中，湿润后取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上，使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密点加试样。干点法操作是将试样点于滤纸上，吹干、再点，反复操作数次至点完规定试样量，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，此法适用于较稀试样溶液的的点样。,操作步骤,十、电泳技术,色谱技术,（4）电泳：将点好试样的滤纸条放在支架上，滤纸条两端下垂浸入电泳槽的缓冲液中，接通电源与电极，调整电压梯度为1820V/cm，电泳约1小时45分钟。,操作步骤,（5）显色：待电泳结束，将滤纸取出吹干或烘干，用相应的显色剂显色即可。,十、电泳技术,色谱技术,（1）缓冲液最适合的离子强度为0.020.2。,（4）如果不能确定适当的显色剂，可用碘蒸气显色。,（2）一般使用的电场强度为10伏特/厘米，电泳2小时。,（3）电泳过程中若电流突然降低，须立即停止，检查原因。,十、电泳技术,操作提示,色谱技术,（5）用于制备样品时，选用较厚滤纸，试样点成长条形，电泳结束后，剪下边上的一小条显色，确定区带位置，再剪下相应部位，用溶液洗脱。,（6）纸电泳结果可帮助了解化学成分的电负性，指导选择其他色谱方法，综合应用，达到分离目的。,十、电泳技术,操作提示,色谱技术,（二）琼脂糖凝胶电泳,是一种以琼脂糖凝胶作为带电质点溶液的支持物来进行电泳的分离方法。具有染色、脱色程序简单，快速，易于回收试样，利于制备，无毒，适用于水平电泳系统，易干成薄膜，可长期保存等优点。,