【硕士论文】苹果树腐烂病菌自苹果树剪锯口侵染发病条件、动态侵染木质部的发病机制与防治药剂研究

论文编号72硕士学位论文腐烂病菌自苹果树剪锯口侵染发病条件、动态与防治药剂研究DISEASECONDITIONS，DYNAMICSANDFUNGICIDESCONTROLOFVALSAPATHOGENINFECTIONFROMAPPLEPRUNINGWOUNDS专业植物病理学研究方向植物病害流行学DISEASECONDITIONS，DYNAMICSANDFUNGICIDESCONTROLOFVALSAPATHOGENINFECTIONFROMAPPLEPRUNINGWOUNDSINFULFILLMENTOFTHEREQUIREMENTFORTHEDEGREEOFMASTEROFAGRONOMY摘要苹果树腐烂病VALSAMALI主要危害主干、主枝，破坏皮层，造成死枝、死树，重者毁园，在中国是苹果树上的第一大病害，严重威胁苹果产业的发展。剪锯口是苹果树腐烂病菌的重要侵染孔口。从剪锯口侵染的腐烂病菌可以长期潜伏在木质部内，木质部导管内潜伏的腐烂病病菌是导致剪锯口发病和旧病斑复发的主要菌源。为了明确腐烂病菌的侵染、扩展以及防治，本论文对腐烂病菌从剪锯口侵染木质部的所需条件、扩展动态、以及影响腐烂病病斑扩展的条件进行了研究，为苹果树腐烂病流行规律和病害防控的进一步研究提供了理理论依据和参考。2013年自3月份开始，每隔一个月一次用标记腐烂病菌的分生孢子，定期接种当年春季新修剪形成的直径1CM左右的剪锯口，定期检查接种剪锯口的发病情况，定期取样分离木质部内的菌丝。结果表明，腐烂病菌能从剪锯口侵染木质部，且能在木质部内生长扩展。411月份，腐烂病菌在木质部内都能生长扩展，但不同季节生长扩展的速度不同。6月份，腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度最快，一个月内的平均扩展距离146CM；4、5和7月份次之，每月的平均扩展距离为05CM、067CM和11CM；7月份之后菌丝的扩展明显变慢，每月的平均扩展距离不超过03CM。次年6月份，菌丝在接种枝条木质部内扩展最大距离达21CM。2013年311月接种的剪锯口，于2014年3月份开始发病，在3、4和8月发病数量最多，发病剪锯口分别占总接种剪锯口的10、813和625，其他时间发病的剪锯口占251。3、4、5、8月份接种的剪锯口发病率较高，分别为40、45、45和30，其他时间接种的剪锯口发病率较低。在所测试535°C下，腐烂病菌的分生孢子都能从剪锯口侵染，在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C和30°C六个温度下接种的技条上，距接种点3CM处的枝段上，能分离出腐烂病菌，其中20°C下病菌的分离率最高，分离率为294，与15°C、25°C和30°C接种的枝条没有显著差异，但与5°C和10°C下接种枝条上病菌的分离率存在显著差异。35°C下接种枝条上，3CM处没有分离到接种的腐烂病菌，但1CM处能分离到接种病菌，说明35°C下腐烂病菌的分生孢子也能从剪锯口侵入，但病菌的侵染率低或侵入后生长缓慢。露时对腐烂病菌分生孢子从苹果枝条剪口侵染没有显著影响。接种后未经保湿0小时处理枝条上，在距接种点3CM处木质部内病菌的分离率为992，与其他6个露时处理枝条上病菌的分离没有显著差异。接种后保湿24小时的处理枝条上，距接种点3CM枝段上病菌的分离率最高，为1786，与其他6个露时处理枝条上的分离率也没有显著差异。温度对从剪锯口侵入木质部腐烂病菌的生长扩展速度影响较大。在25°C下培养7天后，距接种点5CM处枝段上都能分离到接种病菌；35°C下培养的枝条上，在35CM处能分离到病菌；其他温度下培养的枝条上，在45CM处都能分离到接种病菌。春季形成的伤口感病期较长。龄期为1D、3D和7D的伤口对腐烂病菌非常敏感，接种菌饼后发病率为100；15D、30D和45D的伤口接种后发病率依次降低，分别为57、17和3；龄期60D的伤口再接种腐烂病菌的菌饼后不再发病。龄期1D的伤口接种病菌后，形成的病斑扩展面积最大，为1033CM2；随伤口龄期的增加，接种后形成伤口的面积逐渐减小。夏季形成的伤口感病期较短。龄期为1D和3D的伤口接种腐烂病菌后的发病率为100，15D后的伤口接种菌饼后不再发病。通过接种2周后再施药的方法测试了5种杀菌剂对侵入枝条腐烂病菌的铲除效果。腐烂病菌侵染2周后，喷施吡唑醚菌酯和波尔多液对侵染病菌的铲除效果较好，分别达9444和8889；代森锰锌、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑3种铲除效果稍差，铲除效果分别为4444、4444、1667。通过在剪锯口上先施药后接种的方法测试了8种杀菌剂对剪锯口的保护效果和持效期。结果表明，施药后第2D，8种测试药剂的保护效果稍差，从剪口接种枝条内的病菌分离率较高；从施药后第5D开始，其中7种药剂的保护效果明显提高，病菌的分离率明显降低；施药20D后，甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯、波尔多液、戊唑醇的保护效果仍在90以上。通过先在剪锯口接种，然后施药的方法，测试了3种杀菌剂对侵染病菌的内吸治疗效果。结果表明，3种效果都达不到理想效果，其中甲基硫菌灵的治疗效果最好，病菌侵染20D后施药，治疗效果仅达65。关键词腐烂病；剪锯口侵染；发病动态；侵染条件；药剂防治ABSTRACTVALSACANKERVALSAMALIISMAJORDESTRUCTIVEBRANCHDISEASESOFAPPLETREESINCHINA,MAINLYHAZARDSTHETRUNKSANDBOUGHS,DESTRUCTINGCORTICES,ANDTHENBRINGSABOUTTHEDEATHOFTWIGS,TREESORTHEENTIREORCHARDAFTERWARDSSOSERIOUSLYLIMITSTHEDEVELOPMENTOFFRUITINDUSTRYTHEPRUNINGWOUNDSARETHEMOSTSUSCEPTIBLESITESANDALSOTHEMOSTIMPORTANTBYVALSAMALITHEMYCELIUMOFVALSAMALIINFECTEDTHROUGHPRUNINGWOUNDSCANPARASITIZEINTHEDUCKSOFXYLEMFORLONGTIMETHEOUTBREAKFROMPRUNINGWOUNDSANDRECURRENCEOFOLDSCARSARECAUSEDBYTHEMYCELIUMOFTHEPATHOGENEXPANSIONINTHEXYLEMINORDERTOCLEARINFECTION,EXTENSION,PREVENTIONANDCONTROLABOUTTHECAUSALFUNGUS,WESTUDYTHEPATHOGENINFECTION,EXTENSIONDYNAMICS,CHEMICALCONTROLANDTHECONDITIONSOFSCAREXTENSION,WHICHCANPROVIDETHEORETICALBASISANDREFERENCEFORREGULARITYOFEPIDEMICANDPREVENTIONTHEPRUNINGWOUNDSWEREINOCULATEDWITHCONIDIAOFVALSAMALIATEVERYMONTHFROMMARCH2013THEDIAMETEROFPRUNINGWOUNDSWERE1CMTHERESULTSINDICATEDTHATTHEPATHOGENCOULDINFECTXYLEMTHROUGHPRUNINGWOUNDSANDEXTENDINXYLEMTHEMYCELIUMOFVALSAMALICOULDCONSTANTLYEXTEND,BUTTHESPEEDOFEXPANSIONHADDIFFERENCEATDIFFERENTMONTHSFROMAPRILTONOVEMBERINJUNETHEFASTESTGROWTHTHEMYCELIUMWAS146CMTHEMYCELIUMGREWRAPIDLYINXYLEMINAPRIL,MAY,ANDJULYTHEEXTENDEDDISTANCEWERE05CM,067CMAND11CMRESPECTIVELYTHESPEEDOFEXPANSIONWASSLOWERAFTERJULY,WHICHWASLESSTHAN03CMTHEMYCELIUMCOULDEXTENDTO21CMINXYLEMATNEXTJUNEPRUNINGWOUNDSWEREINOCULATEDMONTHLYFROMMARCHTONOVEMBER2013ANDDISEASEDATMARCH2014THENUMBEROFDISEASEDPRUNINGWOUNDSWASMAXIMUM,INOCULATEDATMARCH、APRILANDAUGUSTTHEPERCENTOFDISEASEDPRUNINGWOUNDSWERE10,813AND625ANDTHEOTHERSWAS251THEPERCENTOFDISEASEDPRUNINGWOUNDSINOCULATEDATMARCH,APRIL,MAYANDAUGUSTWASHIGHER,40,45,45AND30THEPERCENTOFDISEASEDPRUNINGWOUNDSWASLOWERVALSACONIDIUMCOULDINFECTEDFROMPRUNINGWOUNDSAT535°CTHEINOCULATEDPATHOGENAREISOLATEDATTWIGSEGMENTS3CMAWAYFROMTHEINOCULATEDENDAT5°C,10°C,15°C,20°C,25°CAND30°CTHEHIGHESTRATEOFISOLATEDPATHOGENWAS294AT20°CISOLATIONRATEHADNODIFFERENCEBETWEEN20°CAND15°C,25°CAND30°C,BUTHADSIGNIFICANTDIFFERENCEWITH5°CAND10°CAT35°C,INOCULATEDPATHOGENCANNOTBEISOLATEDAT3CMOFTWIGSSEGMENTS,BUTCANBEISOLATEDAT1CMTHISSHOWEDTHATVALSACONIDIUMCOULDINFECTEDFORMPRUNINGWOUNDS,BUTTHEINFECTEDRATEORTHESPEEDOFGROWTHWERELOWWETNESSHAVELESSSIGNIFICANTEFFECTONINFECTIONPRUNINGWOUNDSBYVALSACONIDIUMTHEISOLATIONRATEOFPATHOGENATTWIGSEGMENTS3CMAWAYFROMTHEINOCULATEDENDWAS992,WITHOUTWETNESSISOLATIONRATEHADNODIFFERENCEWITHOTHERSIXWETTREATMENTSTHEHIGHESTISOLATIONRATEOFPATHOGENWAS1786ATTWIGSEGMENTS3CMAWAYFROMTHEINOCULATEDENDAFTERINOCULATEDKEPTWETNESSFOR24HANDHADNODIFFERENCEWITHOTHERSIXWETTREATMENTSTEMPERATUREHADSIGNIFICANTEFFECTONTHESPEEDOFPATHOGENICINFECTEDXYLEMFORMPRUNINGWOUNDSBYVALSACONIDIUMTHEINOCULATEDPATHOGENICCOULDBEISOLATEDATTWIGSEGMENTS5CMAWAYFROMTHEINOCULATEDENDAFTERCULTIVATEDFORSEVENDAYSAT25°CAT35°C,INOCULATEDPATHOGENCOULDBEISOLATEDAT35CMOFTWIGSSEGMENTSATOTHERSTEMPERATURETREATMENTSINOCULATEDPATHOGENCOULDBEISOLATEDAT45CMTHEPERIODSUSCEPTIBLEWOUNDSWERELONGERFORMEDATSPRINGWOUNDSWEREINFECTEDMOREEASILYBYTHEPATHOGENANDTHERATEOFDISEASEDWAS100,WHENTHEAGEOFWOUNDSWERE1D,3DAND7DTHERATEOFDISEASEDWOUNDSWASLOWGROWLY,57,17AND3THEWOUNDSCOULDNOTDISEASEAT60DTHEAVERAGEEXPANDINGAREAOFDISEASESPOTSWASLARGESTAT1DAFTERTHEWOUNDSFORMEDANDTHELARGESTEXPANDINGAREAWAS1033CM2WITHTHEAGEOFWOUNDSINCREASING,EXPANDINGAREAOFDISEASESPOTSDECREASEDGROWLYTHEPERIODSUSCEPTIBLEWOUNDSWERESHORTERFORMEDATSUMMERTHERATEOFDISEASEDWOUNDSWAS100WHENTHEAGEOFWOUNDSONLYWERE1DAND3D,INOCULATEDWOUNDSCOULDNOTDISEASEUNTIL15DAYSAFTERTHEWOUNDSFORMEDFIVEKINDSOFFUNGICIDESWERETESTEDFORERADICATIONOFPATHOGENINBRANCHESBYSPRAYEDFUNGICIDESAFTERTWOWEEKSERADICATIONOFPYRACLOSTROBINANDBORDEAUXMIXTUREWEREBETTERWHENPATHOGENINFECTEDAFTERTWOWEEKSANDERADICATIONWERE9444AND8889RESPECTIVELYERADICATIONOFMANCOZEB,THIOPHANATEMETHYLANDDIFENOCONAZOLEWERENOTGOOD,ANDWERE4444,4444AND1667RESPECTIVELYPROTECTIVEEFFECTSANDPERSISTENTPERIODOF8KINDSOFFUNGICIDESWERETESTEDBYINOCULATEDONTHEPRUNINGWOUNDSAFTERSPRAYEDFUNGICIDESTHETESTSHOWEDTHATPROTECTIVEEFFECTSOF8KINDSOFFUNGICIDESWERENOTGOODONTHESECONDDAYSAFTERSPRAYEDFUNGICIDESANDPATHOGENISOLATIONRATEWEREHIGHERPROTECTIVEEFFECTSOF7KINDSOFFUNGICIDESWEREIMPROVEDANDPATHOGENISOLATIONRATEWERELOWERFROMTHEFIFTHDAYSAFTERSPRAYEDFUNGICIDESPROTECTIVEEFFECTSOFTHIOPHANATEMETHYL,PYRACLOSTROBIN,BORDEAUXMIXTUREANDTEBUCONAZOLEWEREREMAINABOVE90PROTECTIVEEFFECTOF3KINDSOFFUNGICIDESWERETESTEDBYSPRAYEDFUNGICIDESAFTERINOCULATEDONTHEPRUNINGWOUNDS。THETESTSHOWEDTHAT3KINDSOFFUNGICIDESALSOHADNOTIDEALEFFECT,BUTPROTECTIVEEFFECTOFTHIOPHANATEMETHYLWASTHEBESTPROTECTIVEEFFECTOFTHIOPHANATEMETHYLWASONLY65WHENWASSPRAYEDONTHETWENTIETHDAYAFTERINFECTEDKEYWORDSVALSAMALIPRUNINGINFECTIONDISEASEDYNAMICSINFECTIONCONDITIONSFUNGICIDESCONTROL目录第一章文献综述111苹果树腐烂病的发生和危害症状112苹果树腐烂病的病原学及致病力研究2121病原菌的来源和多样性研究2122病原菌的致病力机制的研究313病原菌的侵染4131侵染循环4132潜伏侵染414影响苹果腐烂病大流行的因素515病害的防治616本研究的目的和意义8第二章腐烂病菌从剪口侵染的时期、所需条件及在木质部内生长扩展研究921材料与方法9211病原菌及孢子悬浮液的制备9212腐烂病菌从剪口木质部侵染后的扩展动态9213剪口龄期对腐烂病菌从剪锯口侵染的影响10214露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响10215温度对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响1122结果与分析11221剪口木质部内腐烂病菌的扩展动态11222剪口龄期对木质部接种腐烂病菌分生孢子后生长扩展的影响12223露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响14224温度对腐烂病菌在木质部内扩展的影响1623结论与讨论17第三章影响腐烂病病斑扩展和发病的研究2031材料和方法20311供试菌株及孢子悬浮液的制备20312皮层伤口龄期对腐烂病病斑扩展的影响20313枝条龄期对腐烂病病斑扩展的影响20314低温冻害、干旱失水影响腐烂病菌发病的研究2032结果与分析21321春夏季节伤口龄期对腐烂病病斑扩展的影响21322枝条龄期对腐烂病病斑扩展的影响23323腐烂病菌潜伏部位以及低温冻害、干旱失水影响腐烂病菌发病的研究2433结论与讨论25第四章不同杀菌剂对苹果树腐烂病的防治效果2841材料与方法28411供试病原菌28412供试杀菌剂28413对枝条上潜伏病菌的铲除效果28414杀菌剂对从剪锯口侵染病菌的铲除效果29415保护性杀菌剂持效期3042结果与分析30421对枝条上潜伏病菌的铲除效果30422杀菌剂对从剪锯口侵染病菌的铲除效果31423保护性杀菌剂持效期3243结论与讨论35全文小结37参考文献40CONTENTSCHAPTER1LITERATUREREVIEW111THEDAMAGESYMPTOMOFAPPLEVALSACANKER112STUDIESONETIOLOGYANDPATHOGENICITYOFVALSAMALI2121STUDIESONPATHOGENSROUCEANDDIVERSITY2122STUDIESONPATHOGENICITYOFPATHOGEN313INFECTIONOFPATHOGEN4131INFECTIONCYCLE4132LATENTINFECTION414INFLUENCEFACTORSONEPIDEMICOFVALSAMALI515CONTROLOFAPPLEVALSACANKER616THEPURPOSEANDSIGNIFICANCEOFTHISSTUDY8CHAPTER2STUDIESONINFECTIONTIMEANDCONDITIONSOFVALSAMALIFROMPRUNINGWOUNDSANDEXPANSIONINXYLEM921MATERIALSANDMETHODS9211PATHOGENANDSPORES9212EXTENSIONDYNAMICSOFVALSAMALIINXYLEMAFTERINFECTEDFROMPRUNINGWOUNDS9213EFFECTOFPRUNINGWOUNDSAGEONINFECTIONOFVALSAMALIFROMPRUNINGWOUNDS10214EFFECTOFTEMPERATUREANDRHONINFECTIONOFVALSACONIDIALFROMPRUNINGWOUNDS10215EFFECTOFTEMPERATUREONEXTENSIONOFPATHOGENINXYLEM1122RESULTSANDANALYSIS11221EFFECTOFPRUNINGWOUNDSAGEONINFECTIONOFVALSAMALIFROMPRUNINGWOUNDS11222THEEFFECTOFPRUNINGWOUNDSAGEONXYLEMAFTERINOCULATEDWITHVALSACONIDIUM12223EFFECTOFTEMPERATUREANDRHONINFECTIONOFVALSACONIDIALFROMPRUNINGWOUNDS14224THEEFFECTOFPATHOGENEXPANSIONINTHEXYLEM1623CONCLUSIONANDDISCUSSION17CHAPTER3STUDIESONLEISIONAREAEXPANSIONANDDISEASEOFVALSAMALI2031MATERIALSANDMETHODS20311PATHOGENANDSPORES20312EFFECTOFWOUNDAGESOFCORTEXONLEISIONAREAEXPANSIONOFVALSAMALI20313EFFECTOFBRANCHAGESONLEISIONAREAEXPANSIONOFVALSAMALI20314EFFECTOFLOWTEMPERATUREFREEZEANDLOSSWATERDROUGHTONDISEASEOFVALSAMALI2032RESULTSANDANALYSIS21321EFFECTOFWOUNDAGESONLEISIONAREAEXPANSIONOFVALSAMALIINSPRINGANDSUMMER21322EFFECTOFBRANCHAGESONLEISIONAREAEXPANSIONOFVALSAMALI23323EFFECTOFTHELOWTEMPERATUREFREEZEINJURIESANDWATERSTRESSONTWIGSINOCULATEDWITHCONIDIAOFVALSAMALI2433CONCLUSIONANDDISCUSSION25CHAPTER4CONTROLEFFICIENTYOFDIFFERENTFUNGICIDESONAPPLEVALSACANKER2841MATERIALSANDMETHODS28411THEPATHOGEN28412THEFUNGICIDES28413ERADICATIONEFFECTOFFUNGICIDESONLATENTPATHOGENINBRANCHES28414ERADICATIONEFFECTOFFUNGICIDESONINFECTEDPATHOGENFROMPRUNINGWOUNDS29415THEPERSISTENTPERIODOFPROTECTIVEFUNGICIDES3042RESULTSANDANALYSIS30421ERADICATIONEFFECTOFFUNGICIDESONLATENTPATHOGENINBRANCHES30422ERADICATIONEFFECTOFFUNGICIDESONINFECTEDPATHOGENFROMPRUNINGWOUNDS31423THEPERSISTENTPERIODOFPROTECTIVEFUNGICIDE3243RESULTSANDANALYSIS35CONCLUSIONSOFTHEFULLTEXT37REFERENCES40第一章文献综述11苹果树腐烂病的发生和危害症状苹果树腐烂病VALSAMALI是东亚地区危害最为严重的枝干病害，可以侵染苹果树的主枝、主干，破坏枝干皮层，轻者造成枝干枯死、残缺，重者整株枯死，甚至毁园，严重制约着苹果产业的发展。1903年在日本首次发现苹果腐烂病，随后传入北海道、长野等地，1972年北海道发病面积高达943,造成很多果园的毁灭。在我国，该病于1916年被报道发生在辽宁省熊岳城。目前，该病主要分布于东亚地区，我国各苹果产区均有发生，其中北部地区受害最为严重1。一般认为，苹果树腐烂病在我国曾有四次大规模的流行。上世纪40年代末至50年代初，由于战乱，果园荒废，导致苹果树腐烂病第一次规模流行。50年代末，受“大跃进”影响，盲目追求高产，果园管理不当，导致腐烂病第二次流行。十年文化大革命时期，果园疏于管理，导致腐烂病的再次流行。80年代中后期，实行分园到户，果农盲目追求高产，减少投入，导致腐烂病第四次流行1。腐烂病的四次流行造成了严重的经济损失。2002年陕西苹果树腐烂病出现严重发生现象，部分果园的发病率达到了102；2005年王磊等调查发现，陕西关中各苹果产区均有不同程度的苹果腐烂病发生，发病率最高可达92，严重影响了苹果产量及品质和苹果产业的发展3。2006年王金友对陕西苹果产区调查显示，苹果腐烂病的发生呈上升趋势4。目前，苹果树腐烂病仍是苹果树上的第一大病害。2008年，全国苹果产业体系调查结果显示，我国各苹果产区的苹果树腐烂病的总体发病率达5275。2011年，由于受秋季降雨、冬季冻害和春季干旱等多种因素的影响，烟台苹果产区腐烂病发生严重。在结果园内，有新发病疤的病株率高达6820，平均受害枝量为2398，死枝量1074，死株率为2766。现代苹果产业技术体系病虫害防控研究室的有关专家认为,我国的苹果产区正面临着新一轮腐烂病的流行。苹果树腐烂病菌主要危害苹果树的主干、主枝，也可以侵染弱小枝及果实，皮层受害腐烂坏死，危害症状主要分为枝枯型与溃疡型两种。枝枯型主要发生在树势较弱的植株上时，多发生在小枝、果苔。发病初期，病部红褐色，病部蔓延迅速，病斑形状不规则，病健交界处边缘不明显。发病后期，病斑扩展整个枝干，最后导致枝干枯死，病部产生浓密的黑色分生孢子器。溃疡型，发病初期，病部为红褐色，水浸状，稍肿起。用手指按压时下陷，并溢出黄褐色汁液，病组织腐烂时有浓厚的酒糟味，易剥离。后期，病部水分蒸发干燥下凹，变黑褐色，并与健部交界处裂开，之后产生黑色小粒点，即分生孢子器。湿度较大时，从分生孢子器中溢出橘黄色卷须状分生孢子角。苹果腐烂病菌侵染果实后，会造成近圆形或不规则形，黄褐色与红褐色相间的轮纹状病斑，病健分界清晰，发病组织软腐，有酒糟味。后期病斑表面产生略呈轮纹状排列的小黑点，湿度大时，小黑点会产生孢子角。12苹果树腐烂病的病原学及致病力研究121病原菌的来源和多样性研究1903年在日本首次发现苹果树腐烂病时，日本的山田和宫部将其病原菌定名为VALSAMALIMIYABEETYAMADA（无性型为CYTOSPORAMANDSHURICAMIURA）。1941年，日本学者NAKATA研究发现中国北部苹果树腐烂病菌也为VMALI7。1972年，小林享夫根据子囊菌的分类，认为VALSAMALI不能作为一个单独的种存在，应与VALSACERATOSPERMATODEEXFIRESMAIRE的视为同一个种8。对于我国苹果树腐烂病菌的起源，曾有多种说法。李美娜研究认为我国的腐烂病菌的来源可能有两种途径，一是从国外引入带菌苗木，二是中国的某些苹果属植物上可能寄生该病原菌9。刘开启研究发现，苹果树腐烂病可能是由寄生在其他树木上的腐烂病病原菌侵染所得，如山楂腐烂病菌COXYACANTHAERAB、桃树腐烂病菌CLEUCOSTOMASACC（LEUCOSTOMAPERSOONIINITSTOGASHI）和梨腐烂病菌CCARPHOSPERMAFR有性型VAMBIENSPERFR等，因此，他们认为苹果树腐烂病的侵染均可来源于以上几种病菌1011。近年来，对我国苹果树腐烂病菌的研究不断深入，并基本确立了我国苹果树腐烂病菌的主要种类。2004年，樊民周等对危害我国苹果产业从苹果树腐烂病菌的种类做了研究，研究发现苹果壳囊孢属CYTOSPORASP是引起陕西苹果腐烂病的主要病原菌12。2007年，王旭丽等人通过对系统发育的研究，利用RDNAITS序列、表型比较及致病性实验的研究发现，我国苹果树腐烂病菌和梨树腐烂病菌分属两种不同的病原菌类型，VMALIVARMALI只侵染苹果不侵染梨树，VMALIVARPYRI即可以侵染苹果也可以侵染梨树，我国苹果树的3个不同分支中的16个单倍型，表明我国苹果树上存在3种不同的腐烂病菌，即VCERATOSPERMASENSUKOBAYASHI，VMALICOLA，VPERSOONII，并且VCERATOSPERMASENSUKOBAYASHI，无论是分离株的数量还是单倍型数量都是我国苹果树腐烂病菌的优势种类，占所研究分析分离株的961314。2010年，李正力等应用SRAP（SEQUENCERELATEDAMPLIFIEDPOLYMORPHISM，相关序列扩增多态性）和ISJ（INTRONEXONSPLICEJUNCTION，内含子外显子切接点序列）标记技术，分析了我国苹果树腐烂病菌VALSAMALI的遗传多样性并建立了适用于苹果树腐烂病的SRAP和ISJ标记反应体系，同时利用SRAP标记多态性对不同致病性进行了研究表明，SRAP标记多态性与腐烂病菌的致病性存在相关性15；2012年，藏睿等又将VMALI种划分了两个不同的变种，即VMALIVARMALI（VMM）和VMALIVARPY（VMP），其中我国苹果树腐烂病最主要的致病菌是VMM1618。目前我国仍采用此分类结果。122病原菌的致病力机制的研究苹果树腐烂病菌生长温度范围为538，生长适宜温度是2510。最适PH为56，其最适炭源为葡萄糖、麦芽糖16。腐烂病菌分生孢子器形成的最适温度为2030；分生孢子萌发的最适温度为25，在5也能萌发，但萌发率较低。分生孢子在清水中不能完成萌发，其萌发需要一定的营养物质，而这些营养物质大多存在于树皮、果汁、木质部内。子囊孢子萌发的最适温度为19左右，5也能萌发，但萌发率低；子囊孢子能在清水中可以萌发，但萌发需要的时间较长，萌发率较低19。对于苹果树腐烂病菌的致病机制的研究发现，一些酶类和毒素在病原菌的致病作用中起主要作用。苹果树腐烂病菌属弱寄生菌，在其侵染致病过程中，能产生多种毒素、酶类、有机酸和其他次生代谢物质2024。根皮苷代谢产物是腐烂病菌致病过程产生的一类重要毒素，主要包括5种，即对羟基苯丙酸、间苯三酚、对羟基苯乙酮、对羟基苯5甲酸和原儿茶酸，用这些化合物处理苹果枝条，可以引起树皮的坏死，从而指出根皮苷的分解产物可能在病菌引起的病斑扩展上起作用2527。苹果属根皮苷的含量与腐烂病的抵抗力有关，在离体的苹果嫩枝上，根皮苷类代谢产物能够导致与腐烂病菌侵染相似的症状25。除植物毒素外，一些酶类物质在苹果树腐烂病菌的致病性中也起到重要作用。果胶酶是苹果树腐烂病菌的致病性中重要的酶类物质26,2829。苹果树腐烂病菌在致病过程中能够分泌5种细胞壁降解酶，即多聚半乳糖醛酸酶PG、果胶甲基半乳糖醛酸酶PMG、纤维素酶CX、葡萄糖苷酶和木聚糖酶。离体条件下5种酶能浸解苹果愈伤组织，表现与腐烂病发病的初期基本一致的症状；其中5种酶的最大酶活力存在显著差异，木聚糖酶活性最强，暗示木聚糖酶在苹果树腐烂病菌的致病过程中起重要，从而作推测木聚糖酶与苹果树腐烂病菌的致病力存在一定的相关性3031。对于腐烂病菌致病性分化研究，1979年日本学者原田幸雄将培养在马铃薯琼脂培养基上的菌落颜色不同的两类菌系（深褐色、灰褐色）的菌种分别接种在苹果树离体枝条上，结果表明深褐色菌系的致病力较强而灰褐色的致病力相对较弱32。日本学者发现20世纪70年代采集的菌种与20年代保存的菌种在形态、培养性状、致病力方面十分相似。中国农业科学院果树研究所曾对来自我国黑龙江、辽宁、山东、河南、湖北等地的苹果树腐烂病原菌进行研究发现，这些菌种在培养性状、致病力等方面也没有明显的差异。陕西的苹果树腐烂病菌根据菌落颜色可以被划分为三个类群分别为黄褐色类群、乳白色类群和灰褐色类群，并用这三个类群的苹果树腐烂病菌接种秦冠和红富士两个苹果品种的离体枝条，调查研究发现，黄褐色类群的致病力最强，而乳白色和灰褐色类群致病力相对较弱1718。苹果树腐烂病菌VALSAMALI在种内的致病力也存在明显的分化现象，而这种分化与地域没有明显的相关性33。13病原菌的侵染131侵染循环苹果树腐烂病是一种周年发生的病害，每年新感染病斑的出现有两个高峰，早春大量病斑溃烂形成高峰，病菌在树皮上腐生定殖。夏季树势旺盛，树体的抗扩展能力强，不利于病菌侵染，当树势衰弱时，病菌即可从腐生状态转为弱寄生导致发病。春季的腐烂病斑大多出现在向阳面，剥开病斑表面，在木质部表层可见到明显的深褐色侵染点，溃烂病斑腐烂到木质部浅层，其深层溃疡面大于表层。山东地区春季3月份是腐烂病病斑扩展高峰期，也是腐烂病爆发的高峰期。夏季，随着树体愈伤能力和抗扩展能力的增强，病斑的扩展较慢，发病量减少。秋冬季节，树体进入休眠期，前期形成的表面溃疡斑，腐烂病病菌菌丝穿过树皮周皮，继续生长扩展侵害内层或旁侧健康组织，同时在树皮表面出现小病痕，进而引起树皮的腐烂。由于腐烂病菌分生孢子对环境的适应能力较强，所以在冬季的低温环境下也能对树体造成侵染，但病菌的生长扩展速度较慢34。到次年3月份再次出现新病斑。腐烂病菌侵入植物组织中，菌丝主要分布于皮层和韧皮部，破坏寄主细胞，最终侵入木质部导管中35。132潜伏侵染苹果树腐烂病病菌是一种弱寄生菌，主要从剪锯口、冻伤、日灼伤等伤口侵染，也可通过芽眼、叶痕、果痕等处的微伤口侵染，具有潜伏侵染的特点3640。腐烂病菌通过伤口侵入树体后，通常不立即使树体致病，而是处于潜伏状态，是否致病主要取决于寄主的抗病能力,当树体或局部组织衰弱即树势衰弱时，腐烂病菌就会由潜伏状态转为致病状态从而引起树体发病41。苹果树腐烂病的生长扩展与树体的愈伤能力和抗扩展能力有关，早春季节是腐烂病的发病高峰期，此时温度和树体充水度影响树体的愈伤能力，树体的抗扩展能力低，从而利于病菌的生长扩展41。在自然条件下，剪锯口是腐烂病菌侵染的重要途径42。苹果树腐烂病菌的分生孢子可通过雨水传播，分生孢子萌发侵染所需要的环境和营养条件比较容易满足。生长季节超过2MM的降雨就能使腐烂病菌孢子萌发和侵染，子囊孢子的萌发侵染不需要补充营养，除从伤口侵染外，还能从其他部位侵染19。春季苹果修剪，形成大量新鲜剪口，伤流液自剪锯口渗出，伤流液中含有大量的养份，为腐烂病菌孢子的萌发和侵染提供了有利条件，从而分生孢子落到新鲜剪口处便可完成萌发和侵染。311月份，新鲜的剪锯口对腐烂病菌较为敏感，都能受其侵染，而3月下旬至5月中旬侵染量最大43。木质部导管内的腐烂病病菌是导致剪锯口发病和旧病斑复发的主要菌源4447。腐烂病菌侵染剪锯口，并不能使剪口立即发病，而是附着于伤口表面或潜伏在木质部的导管内。当木质部导管内的腐烂病菌生长扩展到达韧皮部后才能致病。腐烂病菌在木质部内可以潜伏长达35年，使木质部变黑，通常果农称之为“黑丝”10,4849。2011年王彩霞等在山东烟台地区调查，在检查的967块腐烂病新病疤中，源自剪锯口侵染的病疤占8004，从旧病斑复发的病疤占60296。14影响苹果腐烂病大流行的因素苹果树腐烂病的发病与树势、树体的愈伤能力有着密切联系。此外，果园的带菌量、树体伤口量、苹果产量、以及气候条件尤其是冻害是影响腐烂病发生的重要因素。挂果枝多的枝条，枝条的愈伤能力相对较弱，腐烂病的病斑扩展速度较快，反之，病斑的扩展速度较慢。在苹果树体产量的大年里，树体的负载量过重，营养储存减少，树体的抗病力减弱，腐烂病的发病情况较重，小年里发病情况相对较轻。树势树势强时，树体的愈伤能力、抗侵入及抗扩展能力较强，不利于腐烂病菌的侵染，即使病菌侵入树体，也处于潜伏状态，一般不会使树体立即发病；果园的施肥管理也影响腐烂病的发生。果园施肥不合理，尤其是缺肥或者是偏施氮肥，会造成树体的抗病能力减弱，削弱树势，腐烂病发病重。在研究报道中，钾肥是苹果树所需的重要肥料50。苹果树叶片中镁的含量以及土壤PH值与腐烂病的发生存在相关关系，土壤的PH值在5以下，则利于腐烂病的发生51。对于树体的修剪不当，造成的伤口或死组织较多，利于病菌的侵入，腐烂病的发生52。气候因素在所有的气候因素中，低温冻害是影响腐烂病发生的重要因素。在我国北方苹果产区中，周期性的冻害或短暂极低温度造成的冻害，都会使树体细胞冻死，造成树皮发生冻伤，导致腐烂病的大流行。冬季温度过低，春季气温回升时出现骤降，会使树皮极易发生冻裂，削弱树势；低温冻害也会使花芽和休眠芽受到危害，为病菌的侵入提供了有利条件5354。秋季的连续阴雨和春季的干旱均不利于树体的休眠和春季的正常发芽生长，削弱树势，加剧腐烂病的发生。例如在2011年烟台地区腐烂病的发生情况的调查中，次年腐烂病的发生较重与上年冬季遭受低温冻害有关55。15病害的防治苹果树腐烂病菌是一种典型的潜伏侵染病害。因此在病害的防控中应以壮树防病，提高树势为中心；遵循病害的发生流行规律，并及时清除果园病菌量、治理病斑，结合保护伤口、防治低温冻害等措施，进行综合防治。农业防治苹果树腐烂病的发生与流行与树势有着密切联系。当树势旺盛时，树体对病原菌的生长扩展具有较强的抗性。因此在农业生产中应以加强果园栽培管理和增强树势为重点，提高寄主的抗性，全面保护树体。1果园的水肥管理改善立地条件，坚持科学合理施肥，施肥量充足，施肥种类齐全。增加磷、钾肥，防治氮肥过多，并在早秋施基肥，提高树体贮藏营养水平。合理灌水，秋季控制灌水量，防治低温冻害；早春季节，适当提早浇水，可以提高树皮的含水量和枝条的充水度，从而降低腐烂病斑的扩展速度。2树体的修剪合理整枝修剪，调整结果量。树体修建时，要坚持轻剪慢剪，避免过度修剪，合理平衡结果枝，尽量避免出现大小年现象。3降低果园病菌量降低初侵染菌源量是降低病害蔓延的主要手段。因此要注意果园卫生，及时清除死树、重病树、病死枝和修剪枝，运出果园彻底烧毁，在剪除腐烂病枝条时，剪锯口要在病斑最下端10CM以下，防治剪锯口因带菌而造成病疤重犯。在春季和冬季修剪枝条时，要对果枝剪进行及时消毒处理，防治带菌枝条的相互传染。同时要及时刮除病斑，降低树上伤口死组织的带菌率和发病率，防治病斑进一步的扩展52。4其他物理措施冬季对结果树刮除老翘皮后进行涂白，可以有效防止冻害并能杀死在树干上越冬的害虫，一般生产上常用的涂白剂有硫酸铜石灰涂白剂、石灰硫磺涂白剂、石硫合剂生石灰涂白剂、石灰黄泥涂白剂56。在冬季也可以用稻草包裹树干来御寒。化学防治化学方法是防治苹果树腐烂病的重要方法之一。当苹果树上出现腐烂病病斑时，选择刮除病斑后立即涂抹化学药剂的方法来保护树体。早在上世纪50年代人们就通过喷施保护性杀菌剂来预防腐烂病的发生，但未取得理想的效果。60年，由于发现了苹果树腐烂病菌具有潜伏侵染的特性，对化学药剂的研究由保护剂转为铲除剂，并筛选出了石硫合剂、福美胂等一些防效较好的药剂，但由于福美胂对果树的叶、果有药害作用，因此该药剂在实际应用中未能很好的防治腐烂病的发生。潜伏在树体上的腐烂病菌在夏季形成的落皮层中侵染、生长扩展，并于次年春季造成病害的盛发。因此保护树体不受侵染是防治腐烂病的重要措施。1988年，王金友经4年研究筛选出了高效、低毒、持效期长的“腐必清”，该药剂能够促进伤口愈合，其防治效果明显优于福美胂57。郜佐鹏在田间的防治试验结果表明，苯醚甲环唑、戊唑醇能有效的防治腐烂病的发生58。在春季修剪枝条后用油漆或波尔多浆喷涂新鲜剪锯口可以阻止腐烂病对剪锯口的侵染；秋末、春初用波尔多浆（硫酸铜生石灰水1352030）涂抹枝干，可以杀死树体表面潜伏的腐烂病菌。由于腐烂病菌具有潜伏侵染的特性，可以在木质部内能够长时间潜伏却不导致树体发病，目前，在实际生产中还没有发现具有高渗透性的化学药剂能够渗透寄主木质部杀死腐烂病菌从而达到治愈腐烂病的目的。因此对于腐烂病的防治还是应该以壮树防病为中心，加强栽培管理，结合及时刮除病斑涂抹药剂加以防治。生物防治随着人们对环境质量的关注，以及对绿色食品的需求，利用生物制剂来防治腐烂病的发生已成为目前研究的一大趋势。因此采用无毒、高效的拮抗微生物防治腐烂病成为生物防治的重要内容。郜佐鹏研究发现，利用在黄瓜、辣椒等7株植物上分离的内生放线菌的无菌发酵滤液可以有效的抑制腐烂病菌分生孢子的萌发、菌丝的生长和病斑的扩展，在田间刮除病斑后涂抹无菌发酵液能有效控制病斑的复发58。徐涛在健康苹果树上筛选出了11株链格孢属真菌，这些真菌对腐烂病菌具有明显拮抗作用并能有效的抑制腐烂病菌孢子的萌发及菌丝的生长，且利用具有拮抗性的内生真菌预先接种健康苹果树枝干后，能有效的提高枝干的抗侵入和抗扩展能力59。张王斌通过大田试验研究表明PAVC乳液能有效防治腐烂病的发生以及病斑复发，防治效果高达881760。吴玉星从东北海棠的树皮内筛选出了对苹果树腐烂病具有拮抗作用的内生细菌，该细菌对腐烂病菌的抑制率达5033，并能促进病疤的快速愈合61。其他防治方法目前，国内外有些专家对腐烂病的研究开始转向寻找抗病栽培品种。国内外普遍推广的富士、嘎啦、元帅等系列的栽培品种对苹果树腐烂病菌均没有抗病性，其中富士品种属于高感品种，因此寻找新的抗病在品种成为研究苹果树腐烂病的一大热点。2011年，KAZUYUKIABE通过种内和种间的遗传杂交繁育新品种的方法，发现了将三叶海棠作为供方亲本培育的苹果品种对苹果树腐烂病有较好的抗性6263。16本研究的目的和意义苹果树腐烂病是苹果最严重的枝干病害。目前，在中国的各苹果产区均有分布，尤其东部苹果产区受害最为严重，并且我国存在着该病再次大规模流行的威胁。剪锯口是腐烂病菌重要的侵染孔口。木质部导管内的腐烂病病菌是导致剪锯口发病和旧病斑复发的主要菌源4447。潜伏于寄主木质部内的腐烂病菌大多从剪锯口侵染，如若条件适宜，菌丝生长扩展导致寄主发病，这也是苹果树腐烂病难以防治的主要原因之一。目前，国内对于苹果树腐烂病菌自剪锯口侵染最终导致寄主发病的流行规律了解甚少。为了更充分的了解腐烂病菌自剪锯口在木质部内的侵染和扩展动态以及侵染所需的条件，更准确的掌握腐烂病的发病动态，本研究采用孢子角直接涂抹剪锯口木质部的方法，在自然条件下系统的研究了腐烂病菌从剪口木质部侵染后的扩展动态和剪口龄期对腐烂病菌从剪锯口侵染的影响；在室内条件下研究了露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响和温度对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响，明确了影响苹果腐烂病菌自剪锯口侵染木质部的条件以及侵染木质部后的扩展动态，最终为理解苹果树腐烂病的发生流行规律提供理论依据，为病害的流行防控提供依据和参考。苹果树腐烂病病斑的扩展和发病受多种因素的影响。一般认为春季是苹果树腐烂病菌侵染的最佳时期也是发病的高峰44。但是对于季节和枝条龄期对腐烂病病斑扩展速度的影响以及枝条被腐烂病菌分生孢子侵染后发病条件的研究不足。为了明确腐烂病病斑扩展影响因素和腐烂病发病条件，本研究通过腐烂病菌菌饼接种一年生枝条皮层，掌握了皮层龄期在春夏不同季节对腐烂病菌侵染和扩展的影响；采用病菌菌饼接种皮层的方法，明确了枝条龄期对于腐烂病病斑扩展的影响；利用分生孢子喷雾接种的方法，掌握了低温冻害和干旱失水对于腐烂病发病的影响，为深入了解苹果树腐烂病的流行规律提供理论依据。自剪锯口侵染的腐烂病病菌是导致木质部发病的主要原因，因此保护剪锯口不受腐烂病病菌侵染，是防治腐烂病发生和流行的重要措施。目前在实际的生产中还没有发现能够完全防治腐烂病发生和流行的化学药剂。本研究通过选择生产中常用的腐烂病杀菌剂，采用分生孢子喷雾接种2周后施药的方法，了解了几种杀菌剂对枝条上潜伏病菌的铲除效果；采用先接种后施药和先施药用接种的方法，筛选了对从剪锯口侵染病菌的铲除效果好以及保护持效期长的杀菌剂,为生产上保护剪锯口提供指导性建议，为苹果树腐烂病的防控提供依据和参考。第二章腐烂病菌从剪口侵染的时期、所需条件及在木质部内生长扩展研究21材料与方法211病原菌及孢子悬浮液的制备野生菌株2009年8月采集苹果树腐烂病病枝，切取病健交界处的病组织转入马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，分离获得腐烂病菌VALSAMALI。用直径08MM的毛细管，自菌落边缘打取菌丝的端部转入PDA中，获得单菌丝分离菌株65。转化菌株采用农杆菌介导转化法ATMT将携带潮霉素B磷酸转移酶基因HPH和绿色荧光蛋白表达基因GFP转入腐烂病菌，获得转化菌株。经离体和活体测定，转化菌株和野生菌株的生物学性状、致病性、以及在苹果枝干上形成的症状都没有差异，与田间自然发病情况一致55。2个菌株都保存于4°C的冰箱中。接种前，将保存的转化菌株从冰箱中取出，接种于PDA培养基中，25°C下黑暗培养35天，取菌落边缘直径5MM新鲜菌饼，接种于大麦粒培养基（浸泡大麦粒70G,蛋白胨1G,蜂蜜水6，灭菌2H），25°C恒温箱中培养15天，大麦粒上可产生大量分生孢子器。取产生分生孢子器的大麦粒，转入含有1水琼脂直径为9CM培养皿中，25°C下保湿培养3天，分生孢子器中溢出大量橘黄色分生孢子角19。用灭菌牙签挑取新鲜孢子角置于纯净水中配置成106个/ML的孢子悬浮液，备用。212腐烂病菌从剪口木质部侵染后的扩展动态3月下旬在青岛农业大学胶州示范园内选取3年生富士苹果的12年生枝条，距基部20CM处剪除枝条形成剪口，剪枝当天接种。用灭菌牙签挑取腐烂病菌转化菌株新鲜孢子角涂于木质部中央而不接触韧皮部，用湿脱脂棉包裹，塑料膜包扎保湿，7天后揭除包扎膜，并标记。接种后每个月剪取6个接种剪口枝条，自接种端开始以05CM为单位，截切成数个茎段，然后以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成4块枝条组织，用75的酒精进行表面消毒2MIN后转移至无菌水中冲洗三次，最后将组织块转移至含有50G/ML潮霉素的PDA培养基中，置于25恒温箱内进行培养。检查记录长出腐烂病菌组织块的数量，并在荧光显微镜下观察是否为接种病菌，以此推断腐烂病菌在苹果枝条木质部内的扩展速度。213剪口龄期对腐烂病菌从剪锯口侵染的影响2013年3月24日，在青岛农业大学胶州示范园3年生的富士苹果树上，随机选取直径大于08CM的枝条200枝，离基部20CM处剪除枝条，形成剪口，并标记。自3月31日开始，每隔一个月左右接种20个枝条。接种时，用灭菌牙签挑取大麦粒上产生的分生孢子角LXS08090116菌株置于剪口木质部中央，用湿润脱脂棉球包裹，外部包扎塑料膜，保湿48小时。接种后，每隔一个月检查记录接种枝条的发病情况，当剪口下方枝段出现长径超过1CM的典型腐烂病斑时，记为发病。214露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响试验测试了7个露温和7个露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响。7个露温分别为5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C和35°C，分别由7台恒温箱控制（BLUEPARDMGC250BP2,SHANGHAIBLUEPARDINSTRUMENTSCOLTD）。恒温箱接种前12小时开启，并设定相应温度。7个露时处理分别为接种后保湿0H、1H、3H、6H、12H、24H和48H。全部试验共49个露温与露时组合，每个组合处理3个枝条。3月份苹果萌芽前，自5年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用消毒的枝剪，将枝条截成20CM枝段，保持剪口整齐，3个一组，插入组培瓶内，加入蒸馏水，使枝条基部浸入水中2CM，每3天更换一次蒸馏水。将水培枝条转入相应温度的恒温内预处理12小时。接种时，从恒温箱中取出枝条，用手持喷雾器，将腐烂病菌转化菌株的分生孢子悬浮液均匀喷撒到枝条的剪口上，直至剪口处有孢子悬浮液流下为止。接种后，除露时处理为0H的枝条不套塑料袋，其他露时处理的枝条，每个组合的枝条套一个塑料袋，然后放回到相应温度的恒温箱中。至处理露时结束，解除套在枝条上的塑料袋，再放回到恒温箱中继续培养。试验期间，恒温箱条取出，将接种端浸入75的酒精保持10秒钟，杀死剪口表面未能侵染的病菌，然内的相对湿度为5080之间，解袋后，剪口表面的露水约在20分钟内蒸发。接种72小时后，将全部枝后转入温度25°C、相对湿度为75的人工气候箱中再培养7天。处理结束将枝条取出，用小刀剥除皮层。然后自接种端开始以1CM为单位，用消毒枝剪（每剪切一次，用75的酒精擦拭消毒