蛋白质分离纯化

蛋白质分离纯化Tag内容描述：<p>1、Protein Engineering南华大学生化与分子生物学教研室办公室第3教学楼315室版权声明本课件版权所有未经允许不得转载。Protein Engineering曹运长博士、副教授南华大学生化与分子生物学教研室Emailcaoychang163.comTel: 15886467200SeparationPurification and Identification of Proteins进行蛋白修饰时需要单一蛋白质为原料需要单一蛋白质来研究其结构与功能需要大量纯化经过改造的蛋白质作为产品开发。为什么要分离、纯化与鉴定蛋白质蛋白质分离、纯化与鉴定的理论基础分子大小带电性质变性与复性溶解特性结晶特性分子表面特性分子形状紫。</p><p>2、第二章 蛋白质的分离与纯化,1,第二章 蛋白质的分离与纯化,一、蛋白质的测定技术 紫外分光光度法 比色法 二、蛋白质的分离提取 蛋白质材料的处理 蛋白质的粗分离 蛋白质的纯化 三、蛋白质的结构解析,2,一、蛋白质的测定技术,3,定义：蛋白质浓度或含量的测定 方法： 凯氏定氮法 紫外分光光度法 比色法 双缩尿法（Biuret法） Folin酚试剂法（Lowry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法） BCA法,4,测定蛋白质含量的是我们研究蛋白质功能等方面的基础，这种技术也广泛应用于食品质量检测方面等。,在选择方法时应考虑： 实验对测定所要求的灵敏度和精。</p><p>3、2） 利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。。</p><p>4、第一章 蛋白质的分离与纯化,蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术 离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等 主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术 不连续系统原理（重点掌握） SDS-PAGE技术（重点掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）,第一节 蛋白质分离纯化的一般原则,根据实验目的选择合适的材料，应遵循：,目的蛋白含量及生物活性尽可能高,材料来源方便、成本低、易操作,可溶性及稳定性要尽可能好,材料的选择,注意：不同的生物体、不同生理状态、不。</p><p>5、蛋白质分离纯化的新技术及技术要点浅述蛋白质分离纯化的新技术 摘 要： 本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术，综和近年来国内外的一些研究结果，结合实际应用的例子，分析了各种分离纯化方法的优点，同时指出其不足之处。文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。 关 键 词： 分离纯化 蛋白质 进展 生物技术的发展非常迅速，基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术，已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。 和其它生物产品的生产过程一样蛋白。</p><p>6、蛋白质的分离纯化,（一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离 （二）粗分级 （三）细分级 （四）结晶,蛋白质的分离方法,根据蛋白质的溶解度差异分离 沉淀技术 根据蛋白质分子大小的差异分离 根据蛋白质的荷电差异分离 根据蛋白质与某些物质的吸附差异吸附分离 利用生物分子专一性结合的特性亲和层析,蛋白质的分离方法,可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀 不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀,透析只用于除盐类和小分子杂质,透析只用于除盐类和小分子杂质,超过滤除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质,加压,蛋白质溶。</p><p>7、血清白蛋白的分离与纯化、蛋白定量测定,实验目的,掌握DEAE纤维素层析法分离纯化蛋白的方法 掌握考马斯亮兰法测定蛋白质的原理,DEAE纤维素层析法分离纯化白蛋白,离子交换层析基本原理,根据待分离物质带电性质不同的分离纯化方法 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进行分离纯化的层析方式,离子交换剂,离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）和反离 子组成。基质一般是不溶性聚合物，如纤维素，交联葡聚糖， 交联琼脂糖等；,树脂 O N+(CH3)2 OH-,纤维素O CH2 COO- Na,基。</p><p>8、第七章 蛋白质分离纯化和表征,王顺昌 2010.10,第一节 蛋白质的酸碱性质 两性电解质，能与酸碱反应，可解离基团主要来自侧链基团解离。P290 sidechain and pKa 蛋白质的等电点:与氨基酸比较，大小与所含酸性与碱性氨基酸数目有关。 蛋白质的等离子点：在没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出来的质子数目与质子受体结合的质子数相等时的pH isoionic point 第二节 蛋白质的分子形状和大小 MW6000-1000000 一、最低分子量：按化学组成测定：微量元素法，最低aa组成推断法。,二、利用渗透压测定分子量 利用半透膜进行测定p292 三、蛋白质。</p><p>9、第七章 蛋白质的分离、纯化,蛋白质分离、纯化主要依据,（1）蛋白质的分子大小 透析、超滤、分子筛层析 （2）蛋白质的带电特性 等电点沉淀、离子交换层析、 等电聚焦电泳 （3）蛋白质的溶解特性 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离,（一）材料 1、选材 2、破碎 3、混合物的分离 （二）粗分级 （三）细分级,采用简单的实验技术手段，比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化，经浓缩后得到蛋白质粗制品。,蛋白质粗分级,一、盐析 盐析：蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。 常用硫酸铵进行沉淀。 分级沉。</p><p>10、蛋白质的理化性质及分离纯化,第一节 蛋白质的理化性质,第二节 蛋白质的分离纯化,第三节 蛋白质的分子量测定,第四节 蛋白质的含量测定与纯度鉴定,第一节 蛋白质的理化性质,一、蛋白质的酸碱性质,二、蛋白质的紫外吸收性质,四、蛋白质的变性和复性,五、蛋白质的呈色反应,三、蛋白质的胶体性质和沉淀,一、蛋白质的酸碱性质,在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。,没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点。,蛋白质等电点。</p><p>11、蛋白质分离纯化与检测技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺(Bis) 在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素(C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛效应。,消除蛋白质分子形状的影响,掩盖不同类蛋白质分子原有的电荷差别,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白。</p><p>12、第七章 蛋白质的分离纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 三、胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质的变性与复性 五、蛋白质分离纯化的一般原则 六、蛋白质的分离纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度,一、蛋白质的酸碱性质,蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。,等电点（pI）: 在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，。</p><p>13、2.6 蛋白质的分离、纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； (2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。 (3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,一、蛋白质分离纯化的一般原则,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、。</p><p>14、凝胶过滤层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质分离纯化及鉴定,凝胶过滤层析法,试验原理,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。,凝胶层析的原理,Kd=(Ve-Vo)/Vi,优点 条件温和 操作简便 损失少回收率高 层析柱可反复使用,凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200；得水值 X 10 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶,凝胶柱的选择,凝胶的前处理,溶胀。</p><p>15、第七章 蛋白质的分离纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与分子量的测定 三、胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质的变性与复性 五、蛋白质分离纯化的一般原则 六、蛋白质的分离纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度,一、蛋白质的酸碱性质,蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。,等电点（pI）: 在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，。</p><p>16、蛋白质的分离纯化方法2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分。</p>