蛋白质的分离与纯化课件ppt课件

第一章 蛋白质的分离与纯化,蛋白质分离纯化的一般原则（掌握） 分配层析的基本理论（重点掌握） 蛋白质的层析分离技术 离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等 主要掌握操作要点及操作过程的注意事项 蛋白质的电泳分离技术 不连续系统原理（重点掌握） SDS-PAGE技术（重点掌握）、IEF（一般了解） 蛋白质的浓缩（了解）,第一节 蛋白质分离纯化的一般原则,根据实验目的选择合适的材料，应遵循：,目的蛋白含量及生物活性尽可能高,材料来源方便、成本低、易操作,可溶性及稳定性要尽可能好,材料的选择,注意：不同的生物体、不同生理状态、不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异,预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除，处理后应立即使用或在冷库中保存,细胞的破碎,先要将细胞和组织破碎，使蛋白质充分释放出来,机械法,匀浆：破碎机体软组织最常用方法之一,组织捣碎：注意维持低温环境,研磨：破碎单一细胞的有效方法，主要用于细菌、酵母等的破碎,物理法,超声法：输入高能超声波可以破碎细胞，破碎效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等,在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用,注意: 超声波产生自由基团和造成的溶液温度升高，可造成敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大,反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质,冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质,低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解,化学法,有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来,表面活性剂(去垢剂)：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等,酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶,特异、快速、精确、可重复、经济,总蛋白含量,蛋白质比活性（specific activity）,得率,利用溶解度的差异分离,盐析法：最经典的方法，常用来进行粗分离,常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等，其中应用最广的是硫酸铵,影响盐析的因素很多，如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点,盐析,硫酸铵沉淀,有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而减少氨基酸侧链基团的解离，降低蛋白质分子表面电荷，使蛋白质分子聚集导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出,温度：在一定温度范围内(040之间)，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加,等电点法：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于凝集 (aggregation)和沉淀 (precipitation)，它的溶解度达到最低,等电点沉淀,根据分子量的不同分离,透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)：是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开,平衡离心法：根据蛋白质分子大小、形状不同进行分离的技术,凝胶过滤 (gel filtration)：又称分子筛层析(molecular sieve chromatography)，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一,透析过程,根据电荷的不同分离,电泳,区带电泳：如醋酸纤维薄膜电泳，PAGE等,等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF) ：具有更高分辨率的电泳技术,毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE) ：在细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析时间短，所用样品量及试剂消耗少，操作模式多，可以进行在线检测和自动化,Agilent 3D CE 毛细管电泳系统,离子交换层析,亲和层析,亲和层析法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效,注意：应该尽量减少纯化步骤，缩短操作时间,目的：避免目的蛋白的变性，保证其生物活性,缓冲液 (buffer),盐、金属离子和螯合剂,还原剂,去垢剂 (detergent),蛋白酶抑制剂,蛋白质的环境因素,第二节 层析的基本理论,1906年 M.Tswett Adsorption Chromatography,1941年 Martin and Synge Partition Chromatography Plate theory Rate theory,假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一 定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂 A物质在两相中相互扩散 A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两 相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数,一、分配定律,CAS,分配定律表明： 一定的条件下，一定的物质其K值不变 条件改变其K值随之改变 K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度,CAM,= K,二、分配层析的机理,假设有两种物质，在一定的条件下，它们的分配系数K不同，则通过一根分配层析柱可以将它们分离。为了便于讨论，我们做如下几个假设： （1）层析柱可分成许多层， M是流动相， S是固定相，M和S是互不混溶 （2）分配层析柱中，每一层左右相通，层与层之间互不相通，也就是说在层析柱中只有横向扩散而无纵向扩散,分配层析柱理论塔板示意图,（3）在分配层析柱中，溶质在两相中达到分配平衡的速度很快，并且A物质的存在不影响B物质的分配性质，反之亦然 （4）在该溶剂系统中，A和B两物质的分配系数分别设为：,KA =,CAS,CAM,= 1,KB =,CBS,CBM,= 1/3,如果在层析开始时，在第一层的S相中同时加入A和B两种物质，加入的量均为1。根据分配定律，M加入后，在两相中立刻进行分配，并且很快达到分配平衡。第一次分配前后A和B物质在S和M相中的量为：,A和B物质在层析柱中 1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次,二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行,理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？,因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽,Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。,一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？,塔板理论的要点： 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得,三、塔板理论,第三节 蛋白质的层析分离,层析柱 泵系统（缓冲液） 检测器（记录仪） 部分收集器,液相层析的基本装置,一、离子交换层析 (ion exchange chromatography),原理： 利用生物大分子与具有相反电荷的离子交换剂之间相互作用不同而进行的分离,类型： 阴离子交换剂 (anion-exchange chromatography) 阳离子交换剂 (cation-exchange chromatography),样品的准备 剂型的选择 离子交换剂的预处理 装柱(样品体积的2-5倍） 柱效应的标定 上样 洗脱,操作要点：,分步洗脱法 (stepwise elution) 梯度洗脱法 (gradient elution),目的蛋白的鉴定与回收,离子交换剂的再生与储存,离子交换层析,原理： 利用分子筛效应分离提纯具有生物活性的生物大分子物质,二、凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography),凝胶的种类：,琼脂糖凝胶 (Sepharose) 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex) 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶(Sephacryl),样品的准备 凝胶的选择与处理 装柱（L:W=50-100:1） 柱填充的检测 上样（1%-5%) 洗脱 目的蛋白的鉴定与回收 层析柱再生与储存,操作要点：,凝胶过滤层析的应用：,脱盐 蛋白质分离 相对分子质量测定,凝胶过滤,用途,蛋白质纯化 蛋白质纯化后脱盐 蛋白质分子量测定 研究蛋白质寡聚体,原理： 利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的分离方法,三、亲和层析 (affinity chromatography),改变大分子物质与配体之间的亲和力 改变pH梯度,洗脱：,亲和层析,四、其它层析技术,高效液相层析 (HPLC),疏水作用层析 (hydrophobic interaction chromatography),反相层析 (reversed phase chromatography),第四节 蛋白质的电泳分析,一、定义(electrophoresis),带电质点或颗粒在电场作用下向着与其电性相反的方向运动,需要说明以下几点：,带电质点可以是带电的胶体颗粒、离子、甚至一些 非极性的物质，只要其颗粒在胶体大小范围，在电 场中也能向其相反方向运动,带电质点的净电荷与迁移率有关，带电性质决定其 运动方向,生物体内的小分子，氨基酸、多肽、嘌呤、嘧啶 及超过小分子的病毒、细胞器在电场中都能向与 其电性相反的方向运动,三、电泳的分类,在溶液中进行的没有支持介质的电泳，也称移动界面电泳(moving boundary electrophoresis),自由电泳 (free electrophoresis),区带电泳 (zone electrophoresis),将应用支持介质的电泳称为区带电泳,另一涵义：它表示在一个电场的作用下，在某一种支持介质上，能将一种混合物分离成若干条区带(若干组分)的电泳过程,是带电的物质，都可采用某种电泳技术，分离成 不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析 样品用量少 设备简单 可在室温进行 操作简便，消耗时间不多 不同类型的电泳，有不同的用途 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大提高 分辨率,区带电泳只所以发展如此迅速，是由其本身的优点决定的：,任意物质质点，由于其本身的解离作用或由于表面上吸附有其它带电质点，在电场中便会向一定的电极移动,四、电泳的原理,蛋白质分子： 带电的性质和多少 pI,指带电质点或颗粒在单位电场强度下的泳动速度,五、电泳的迁移率M (mobility),2. 公式：,3. 影响迁移率的主要因素：,带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状,1. 定义：,电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度， 或电势梯度,溶液的pH值：决定带电颗粒的解离程度，亦即 决定所带净电荷的多少,溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强 度越高，电动电位越小，泳动 速度越慢,电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正 或负离子使溶液相对带电，在电场作用下， 溶液就向一定的方向移动,是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电方法。Raymond S和Weinfraub L在1959年最早建立此方法。后来得到Ornstein L和Davis R J的推荐和发展，在1964年，他们又从理论上、实验技术上作了进一步的阐明和改进后，才被推广使用,六、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),机械强度好，有弹性透明，相对地化学稳定，对 pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非 离子型的 没有吸附和电渗作用. 通过改变浓度和交联度， 可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝 胶的重复性好 由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备， 不致污染样品,1. 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备,性能：,原料：丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis),制备：,催化剂：引发剂（过硫酸铵, (NH4)2S2O8 ） 加速剂（四甲基乙二胺, TEMED ）,化学聚合和光聚合两种：,凝胶浓度和交联度：,不连续系统制备过程：,The separating gel pipetted into the plastic cassette,Preparation for the Separating Gel,制备分离胶,Pipetting of water onto the separating gel,Creating the Stacking Gel and Wells,The stacking gel is pipetted on top of the polymerized separating gel,制备浓缩胶,Before the stacking gel polymerizes, fully insert the comb into the top of the plastic cassette.,Casting the gel,Remove the plastic comb from the gel cassette to expose the wells,加样,Loading samples into the wells,在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液 所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分，pH及电位梯度不一样,2. 不连续系统原理概要,在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应 由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高,凝胶层的不连续性： 浓缩胶 (stacking gel) 分离胶 (separating gel),缓冲液离子成分的不连续性： 快离子(前导离子, leading ion) 慢离子(尾随离子, trailing ion) 缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,the buffer counter ion),电位梯度的不连续性： 在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的,pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液,甘氨酸,HCl,蛋白质,样品,浓缩胶 pH6.8,分离胶