张凤丽答辩

原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名张凤丽日期2005年5月18日1重组人IFN2B治疗子宫内膜异位症模型的免疫机制研究02级硕士张凤丽导师谢梅青副教授2前言3研究背景N子宫内膜异位症简称内异症是育龄妇女的常见病，痛经、不孕为其主要临床表现。NEM发病率约1015。N不孕妇女中EM发病率3050。NEM中不孕的发病率为2535。N在慢性盆腔痛患者中经腹腔镜检证实有3050是内异症。内异症严重影响了妇女的身心健康内异症严重影响了妇女的身心健康4研究背景内异症的病因学说N经血逆流学说经典学说N体腔上皮化生学说N良性转移学说N环境学说N基因学说N免疫学说研究热点5研究背景内异症的病因学说N研究表明7690生育年龄妇女会发生经血逆流,但只有1015的妇女患子宫内膜异位症。N1980年，WEED和ARQUEMBOUG就指出子宫内膜异位症是一种与自身免疫有关的疾病。6研究背景内异症的病因学说N2001年，NOTHNICK称内异症为一种自身免疫性疾病。N目前学者们认为免疫系统的异常对于子宫内膜异位症的种植、粘附、生长等各个环节起着重要作用。免疫学说已获得普遍认同免疫学说已获得普遍认同7研究背景内异症与细胞免疫NT淋巴细胞是机体产生特异性细胞免疫应答的重要细胞CD3代表全部T淋巴细胞；CD4代表辅助性T细胞TH；CD8代表细胞毒性T细胞TC和抑制性T细胞TS；T淋巴细胞各亚群失衡免疫系统改变淋巴细胞各亚群失衡免疫系统改变8研究背景内异症与细胞免疫N众多研究发现内异症患者血清、腹腔液中的CD3、CD4比率及CD4/CD8比值降低，TH与TS细胞比例失衡，CD4/CD8比值倒置，指出子宫内膜异位症的发生、发展与患者的细胞免疫功能低下有关。内异症患者多存内异症患者多存在在细胞免疫功能细胞免疫功能缺陷或低下缺陷或低下9研究背景内异症与体液免疫N目前国内外学者也证明了内异症患者体内存在下列抗体增多非器官特异性的抗体抗多核苷酸类、抗组蛋白及抗磷脂、心脂类抗体、抗LAMININ1抗体等器官特异性抗体AOA、AEA等内异症患者存在体液免疫反应增强内异症患者存在体液免疫反应增强10研究背景内异症与细胞因子N活化的CD4辅助细胞分为TH1细胞IL2、IL12和干扰素等，反映机体的细胞免疫状态；TH2细胞IL4、IL5、IL10和IL13等,反映机体的体液免疫状态TH1/TH2细胞因子动态失衡疾病发生细胞因子动态失衡疾病发生11研究背景内异症与细胞因子N目前发现，内异症患者TH1/TH2细胞分泌的细胞因子水平发生了转变，TH1/TH2失衡，TH1向TH2漂移，使子宫内膜能够逃避免疫监视及杀伤而在异位种植，引起内异症的发生发展。内异症存在内异症存在1/2失衡失衡12研究背景内异症的治疗药物性激素抗性激素类手术此两种方法均没有考虑到内异症此两种方法均没有考虑到内异症患者整体免疫状态的调节患者整体免疫状态的调节不良反应多，复发率高，五年复发率均在不良反应多，复发率高，五年复发率均在40左右，效果不理想。左右，效果不理想。单纯切除病灶、术单纯切除病灶、术后复发率高，易造成新粘连后复发率高，易造成新粘连。13研究背景内异症的免疫治疗N内异症的免疫病因学研究进展改善机体的免疫功能新的EM治疗法免疫调节剂N目前一些免疫抑制剂如CORTICOIDS类皮质激素、INDOMETHACIN消炎痛、PENTOXIFYLLINE已酮可可碱等其副反应较大，在临床上受到限制14研究背景内异症的免疫治疗抗病毒、抗肿瘤干扰素增强巨噬细胞的功能、提高NK细胞活性减少IGE的产生、调节机体免疫功能开始在实验室及临床应用于内异症15研究背景内异症的免疫治疗N1999年，INGELMOJM等发现IFN2B腹腔或皮下注射干扰素治疗内异症模型，发现异位病灶明显缩小；2000年,BAHAFATEEN等采取腹腔内一次性置入IFN2B治疗EM患者，复发率降低，妊娠率提高，推测干扰素可用于内异症的治疗。N2001年，SHAWKYZA及2005年，NISHIDAM等体外也发现IFN可抑制异位子宫内膜细胞的DNA合成，促进异位子宫内膜细胞凋亡。干扰素可作为一种免疫调节剂用于干扰素可作为一种免疫调节剂用于内异症的治疗内异症的治疗16研究背景内异症的免疫治疗总结INGELMOJM实验只是单纯从用药前后病灶大小来推测干扰素治疗效果，用药的时间过短，而BAHAFATEEN的实验也是一次性腹腔用药，SHAWKYZA及NISHIDAM的实验都是一些体外研究。干扰素治疗内异症的具体机理是干扰素治疗内异症的具体机理是17研究立题本研究拟建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，通过不同用药途径观察重组人IFN2对内异症异位病灶的作用，并检测内异症大鼠治疗后细胞免疫和体液免疫的多项指标，探讨重组人IFN2治疗子宫内膜异位症的可行性及临床应用前景。18研究目的1通过成功建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，为研究重组人IFN2B对此病的治疗效果提供良好的基础。2研究重组人IFN2B不同治疗方案对SD大鼠子宫内膜异位症模型病灶的发生和发展的抑制作用，探索内异症免疫治疗的新方法。3研究重组人IFN2B对大鼠子宫内膜异位症模型细胞免疫及体液免疫功能的影响，探讨治疗机理。19材料与方法20实验步骤及方法大鼠建模随机分组成功后F组组同时药物干预E组组G组D组C组B组A组测量用药后病灶大小用药四周后，处死大鼠取血清、全血及病灶用药四周后，处死大鼠取血清、全血及病灶流式测定T淋巴细胞亚群血清IGG、IGA、IGM的测定血清IL2、IL4的测定取异位病灶及盆腔脏器做病理药物、安慰剂干预或不干预药物、安慰剂干预或不干预21实验方法动物模型的建立自体移植（粘膜面裸露）法移植物成功的指标为肉眼观体积明显增大，呈隆起透亮的囊泡状，内部充满淡黄色或清亮积液，或形成灰白色小结，部分移植物被结缔组织覆盖，表面血管清晰可见。病理示具有内膜上皮细胞、腺体及间质细胞,部分可见到分泌活动。22实验方法动物模型的建立分组与用药选择异位病灶生长良好的大鼠48只，按异位病灶大小分层随机法分为五组。E、F组在建模的同时向腹腔内放入不同剂量的干扰素A组腹腔持续应用干扰素组1210万单位/次,Q2W4WB组皮下持续应用干扰素组12剂量同上C组腹腔内注射空白对照组8NS05ML/次,Q2W4W23实验方法动物模型的建立D组皮下注射空白对照组（N8）剂量同上E组腹腔单剂量置入干扰素2B60万单位组12F组腹腔单剂量置入干扰素2B120万单位组12G组模型空白对照组（N8）于用药四周后处死大鼠，取组织及血液待检24实验方法移植物肉眼观于用药前后用两脚规测量移植物大小，观察前后体积（V长宽高）变化，并与对照组相比较。25实验方法病理检查在用药前、后分别随机取部分异位病灶组织，处死大鼠时取肝脏、肾脏脏器连同在位内膜做病理观察，观察干扰素对异位病灶的影响及对脏器器官的改变。26实验方法全血CD3、CD4、CD8T淋巴细胞亚群的测定流式细胞仪测定法血清IGG、IGA、IGM含量的测定免疫比浊法血清IL2、IL4的测定ELISA法27统计结果用S表示，数据用SPSS110统计软件处理，组间比较用方差分析及配对T检验，各组之间两两比较用LSD方法，若方差不齐用TAMHANE检验。各组生长率相互比较用RC四格表比较，P005为差异有显著性。28结果291、动物模型制备情况动物建模后的生长情况52只SD大鼠有48只建模成功，成功率为923，各个移植部位的异位内膜生长情况不同表111未干预时SD大鼠内异症模型异位病灶的生长率建模位置建模例数生长例数生长率（）左卵巢系膜4840833左子宫系膜4837771小肠系膜483675右腹壁4842875合计192155807301、动物模型制备情况移植物肉眼观建模成功的病灶（小肠系膜上）建模成功的病灶（卵巢旁）311、动物模型制备情况病理学改变未干预前异位病灶病理改变异位病灶上皮细胞呈高柱状生长，内膜上皮细胞见核下空泡异位内腺体数目多，腺腔大，腺上皮呈柱状或乳头状，增生现象明显322、重组人IFN2B对异位内膜干预时模型的制备情况图21未用药时与干扰素干预时各个移植部位的异位内膜生长情况333、重组人IFN2B对子宫内膜异位症模型大鼠异位内膜的影响34图31重组人干扰素2B用药后肉眼观察移植物体积变化P005与对照组用药前后比较；P005与自组用药前比；A、B组用药前比较35图32重组人IFN2B持续用药组对异位内膜病理学的影响干扰素皮下持续用药后的异位内膜上皮及腺体上皮细胞呈单层分布40干扰素腹腔持续用药后异位内膜上皮细胞坏死脱落4036图33重组人IFN2B单剂量置入组对异位内膜病理学的影响E组用药后异位内膜上皮呈单层，部分细胞已脱落40E组用药后部分上皮细胞仍呈立方状分布，核深染，核仁明显40F组上皮细胞部分脱离40E组在位内膜无明显变化40374重组人IFN2B对子宫内膜异位症模型大鼠血浆CD3、CD4、CD8T淋巴细胞的影响38图41各组大鼠血浆CD3、CD4、CD8T淋巴细胞水平395、重组人IFN2B对子宫内膜异位症模型大鼠血清IGG、IGA、IGM的影响40图51各组大鼠血清IGG、IGA、IGM水平P005,与C、D、G组比较416、重组人IFN2B对子宫内膜异位症模型大鼠细胞因子IL2、IL4的影响42图61各组大鼠血清IL2、IL4水平P005与对照组相比较；P005与E组相比较；P005与F组相比较43P005与对照组相比较；P005与E组相比较；P005与F组相比较图62各组大鼠血清IL2/IL4比值447、重组人IFN2B对内异症大鼠肝脏、肾脏的病理影响干扰素用药后肝脏、肾脏未发生明显病理改变45讨论46关于子宫内膜异位症动物模型的建立及意义N自发性子宫内膜异位症模型如恒河猴、南美猕猴、狒狒等发病率低，饲养条件高，观察周期长，在研究应用方面受到限制。N移植性子宫内膜异位症模型如裸鼠、SCID小鼠不适于研究机体免疫方面。47关于子宫内膜异位症动物模型的建立及意义N诱发性子宫内膜异位症模型猕猴价格昂贵,不易普及；兔子主要应用于研究内异症对卵子释放、拾卵、卵子运送的影响；大鼠性激素水平较高，动情周期短且规律，繁殖能力快，为经济型动物，且模型容易建立，成功率高。48N本课题主要是从免疫调节方面探讨重组人干扰素2B治疗大鼠内异症模型的机理，因此采用了SD大鼠制备的EM模型。N建模时间在动情期或动情前后期；建模方法自体移植法N依据学说子宫内膜种植学说；建模部位临床好发部位总建模率为923比RAJKUMARK等报道的7585造模成功率高；郑澄宇等报道的65造模成功率高模型的成功建立为研究干扰素对此病的影响及观察其治疗效果提供了良好的基础49重组人IFN2B持续用药对内异症模型大鼠异位内膜的影响N本研究发现重组人IFN2B腹腔注射或皮下注射10万单位持续用药可使内异症模型大鼠异位病灶体积明显缩小。N镜下见异位子宫内膜腺体和间质减少，上皮细胞呈扁平状或坏死脱离，内异症大鼠的正位子宫内膜也部分出现异位上皮细胞的萎缩，盆腔内粘连减轻。50重组人IFN2B持续用药对内异症模型大鼠异位内膜的影响N推测IFN连续用药可促进异位子宫内膜的萎缩，对子宫内膜异位症的治疗效果良好，皮下用药与腹腔用药对异位内膜的影响结果相似。提示在临床上我们可以采取较简便的应用方法皮下用药法来达到同样的治疗效果。51重组人IFN2B单剂量用药对SD大鼠内异症模型的成模干预作用N本研究发现在异位内膜形成前单剂量应用重组人IFN2B可明显降低异位内膜的存活率，120万单位对异位病灶的抑制效果更明显。N病理显示存活的异位内膜腺体和间质减少，部分有明显萎缩。但也有部分病灶呈增生现象。N我们可以推测在异位内膜种植于腹腔内尚未形成异位病灶之前，预防应用干扰素可以防止子宫内膜异位症的发生发展。52重组人IFN2B持续用药对内异症大鼠细胞免疫功能的影响N本研究发现重组人IFN2B连续使用四周后，血清CD3、CD4百分率及CD4/CD8比值均见明显升高，提示干扰素治疗后，内异症大鼠体内TH增多，TS减少，提高了内异症模型大鼠细胞免疫功能状态，加强了机体对异位内膜的排斥作用，推测这可能是干扰素持续用药有效治疗内异症、降低其复发率的机理之一。53重组人IFN2B单剂量用药对内异症大鼠细胞免疫功能的影响N本研究发现重组人IFN2B单剂量应用后CD4T淋巴细胞百分率及CD4/CD8比值明显升高，与重组人IFN2B持续用药组相比CD3、CD4T淋巴细胞亚群百分率降低。N提示内异症发生之前应用干扰素可调整机体整体免疫水平，从而得以减轻延缓内异症的发生发展。54重组人IFN2B单剂量用药对内异症大鼠细胞免疫功能的影响N重组人IFN2B持续用药较单剂量用药对改善机体的细胞免疫功能效果更好，可能是重组人IFN2B用药时间与机体免疫力呈正相关有关。N通过本实验可推荐，测定T细胞亚群对于内异症的疗效观察及预后判断具有一定的临床意义。55重组人IFN2B对内异症大鼠血清IGG、IGA、IGM的影响N本实验发现重组人IFN2B连续用药降低了内异症大鼠IGG、IGA水平，推测可能在一定程度上降低了内异症模型大鼠过高的体液免疫功能。N预防性应用重组人IFN2B可能是抑制了大鼠过高体液免疫的发生，从而阻止了内异症的发生及发展。56重组人IFN2B持续用药对内异症大鼠血清IL2、IL4的影响N本研究发现重组人IFN2B连续用药后内异症模型大鼠IL2水平明显升高,IL2的升高维持了机体的正常免疫功能。NIL2/IL4比值的升高提示重组人IFN2B可能逆转了TH1型向TH2型偏移,恢复了TH1/TH2之间的平衡，这也可能是重组人干扰素2B持续用药对内异症治疗作用机理之一。57重组人IFN2B单剂量用药对内异症大鼠血清IL2、IL4的影响N研究表明预防性应用单剂量重组人IFN2B不足以以刺激TH1型细胞活化或使活化的T淋巴细胞产生细胞因子。N重组人IFN2B单剂量的置入预防性地减少了TH2细胞因子的产生，从而预防了TH1型细胞因子向TH2偏移，此可能是预防内异症发生发展的机理之一。58重组人IFN2B单剂量用药对内异症大鼠血清IL2、IL4的影响N临床上，内异症手术后的复发率50左右，根据本实验结果推测手术后预防性腹腔内放置重组人IFN2B可能会预防内异症的复发。59重组人IFN2B对内异症大鼠肝脏、肾脏的影响N重组人IFN2B持续用药或单剂量用药，内异症大鼠的肝脏及肾脏组织未出现明显病理变化，推测单剂量或连续应用重组人IFN2B还不足以导致机体脏器发生器质性改变，但是否对内异症大鼠造成远期影响还需进一步探讨。60结论61结论1本研究采用自体子宫内膜移植法建立SD大鼠内异症模型，成本较低，手术易行，建模成功率高，异位内膜生长良好，