呼吸道感染的实验室诊断

呼吸道感染的实验室诊断,山东省立医院检验科微生物室 邵春红,2018/4/24,1,临床意义低的标本痰、咽拭子粪便、肛拭子 临床意义中等的标本尿脓、伤口分泌物、气管吸取物临床有意义的标本血、脑脊液、组织、肺泡灌洗液、胸水、腹水、无菌体液,2018/4/24,2,呼吸道标本的送检情况,检验方法,2018/4/24,4,呼吸道标本涂片与培养的目的,呼吸道感染肺炎、气管炎抗生素使用后菌群变化用于肺部感染的鉴别诊断 帮助临床正确诊断和治疗,2018/4/24,5,痰标本送检指征,咳嗽咳痰：下呼吸道感染最常见的症状。咯血：包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。呼吸困难：呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。胸部影像学检查提示有感染可能。,肺部渗出性影像学改变伴咳嗽咳痰脓性痰,2018/4/24,6,呼吸道标本的种类,痰： 自然咳痰法 支气管镜采集法 气管穿刺法 胃内采痰法 做TB菌培养其阳性率比咳痰高10%左右鼻咽拭子气管和支气管分泌物抽吸液纤维支气管镜刷检物肺泡灌洗液 ：定量接种，菌落计数肺组织：延长培养时间，排除污染的可能 采集标本以清晨为宜，这个时间段痰量较多。,2018/4/24,7,支气管镜采集标本,支气管肺泡灌洗液：定量培养，104CFU/ml，具有诊断意义。保护性毛刷：毛刷约仅能获得0.001ml标本，在空气中很快会干燥导致细菌死亡，从而影响检出率，应放置于1ml液体运送培养基（如生理盐水和无菌肉汤）。经气管肺组织活检：滴加少量无菌生理盐水保持标本湿润，室温送往实验室，禁止冷藏。,8,2018/4/24,支气管肺泡灌洗液和保护性毛刷定量培养，比痰培养更有临床诊断价值。,及时送检，晨痰如果不能在2小时内送检或接种，应冷藏保存，但会影响苛养菌的检出率，也可考虑留取随机痰自肺部咳出的痰,2018/4/24,9,肺部感染常见病原菌,2018/4/24,10,1857株呼吸道标本分离的病原菌构成,2018/4/24,11,痰涂片的目的,2018/4/24,12,2018/4/24,13,痰涂片的影响因素,2018/4/24,14,另外，还有好的染色结果，正确的回报。,2018/4/24,15,16,2018/4/24,痰涂片的局限性,病原菌复杂多变：我们查到的病原菌常常是气道的炎症而不一定是肺部的炎症。另外，临床上肺部感染复杂多变，常常是混合感染。革兰氏染色的局限性：非典型病原体如支原体、衣原体、立克次体、病毒、马内菲青霉菌、军团菌、利士曼原虫、卡氏肺孢子菌、隐球菌等均存在很大的缺陷，还需要其他染色方法进行补充。,17,2018/4/24,根据痰涂片评价标本质量,注释：分类中1-3类不做培养，要求重新留取标本；4、5类为合格标本；6类为气管穿刺时，如未见白细胞，而鳞状上皮细胞10/低倍视野应重新留取标本。,2018/4/24,18,2018/4/24,19,2018/4/24,20,2018/4/24,21,2018/4/24,22,2018/4/24,23,2018/4/24,24,2018/4/24,25,2018/4/24,26,2018/4/24,27,2018/4/24,28,2018/4/24,29,2018/4/24,30,2018/4/24,31,2018/4/24,32,2018/4/24,33,2018/4/24,34,2018/4/24,35,2018/4/24,36,2018/4/24,37,38,2018/4/24,如何报告痰涂片中的真菌？,孢子酵母样孢子念珠菌，隐球菌，毛孢子菌，双向真菌，马拉色菌非酵母样孢子曲霉菌的孢子菌丝假菌丝-有菌丝生成的念珠菌曲霉菌丝有隔真菌丝，成45度角分枝毛霉菌丝-宽大的分支不分隔的菌丝，飘带样。暗色真菌菌丝-菌丝本身现暗茶色或棕色，提示暗色真菌感染,2018/4/24,39,2018/4/24,40,2018/4/24,41,2018/4/24,42,2018/4/24,43,2018/4/24,44,2018/4/24,45,六胺银染色法,真菌的细胞壁富含多糖，经过碘酸氧化后释出醛基，直接将硝酸银还原成金属银，而使真菌或肺孢子菌细胞染成棕黑色，使其轮廓更加清晰，与浅绿色背景形成反差而易辨认。,操作步骤,1. 1%过碘酸染色10min，弃去溶液，流水冲洗。2. 硝酸银溶液56 染色40min，弃去溶液，流水冲洗。3. 0.25%氯化金溶液染1-2min，回收染液，流水冲洗。4. 3%硫代硫酸钠溶液染色1min，弃去溶液，流水冲洗。5.0.1亮绿染色1min，回收染液，流水冲洗。,2018/4/24,48,2018/4/24,49,2018/4/24,50,检验方法,2018/4/24,51,涂片,痰消化,洗痰,涂片与接种同时进行，不洗痰，消化视情况而定,2018/4/24,52,呼吸道标本细菌培养,真菌,2018/4/24,53,真菌培养,2018/4/24,54,cgl,cal,ckr,ctr,放线菌培养,2018/4/24,55,奴卡菌培养,2018/4/24,56,支气管肺泡灌洗液保护性毛刷肺组织活检,57,2018/4/24,定量接种,研磨后接种,痰培养的难点,合格率低易受上呼吸道正常菌群污染， 难以判断定植还是感染病原菌多样，阳性检出率低判断标准不统一,2018/4/24,58,2018/4/24,59,痰细菌培养的价值,排除 污染菌及 定植菌细菌及药敏结果更多是提供一种变化趋势指导总体用药的框架 作为个体是否用药必须结合临床 只有合格标本培养出的病原菌才具有临床意义，其药敏结果才具有治疗价值。,2018/4/24,60,寻找致病菌的条件,标本是否合格患者情况：病房、年龄、临床诊断等细菌生长情况：优势菌细菌的致病性：苛养菌、少见菌,2018/4/24,61,2018/4/24,62,2018/4/24,63,2018/4/24,64,痰培养如何确定致病菌 ？,1. 痰的性状、气味对诊断有一定帮助 脓性多为细菌性感染 铁锈样痰：肺炎链球菌 红棕色胶冻样痰：肺炎克雷伯菌 脓痰有恶臭：伴厌氧菌感染 痰中有血：结核分枝杆菌,2018/4/24,65,痰培养如何确定致病菌 ？,2. 合格痰标本培养优势菌中度以上生长(+)3. 合格痰标本细菌少量生长，但与涂片镜检结果一致 (肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等)4. 3d内多次培养或连续3次培养到同一细菌高度怀疑5. 痰培养与胸水或血培养结果一致，肯定是此菌感染,2018/4/24,66,痰培养如何确定致病菌,健康人痰中约有20%-30%可查见念珠菌诊断肺念珠菌病: * 要求连续3次以上痰培养有念珠菌生长 * 涂片可见菌丝 * 肺部影像学有病变,2018/4/24,67,2018/4/24,68,呼吸道致病菌鉴定顺序,2018/4/24,69,多关注苛养菌,肺炎链球菌流感嗜血杆菌溶血链球菌卡他莫拉菌艾肯菌 因生长缓慢，需延长培养时间3-7天,2018/4/24,70,苛养菌的定义,是一类对营养及生长环境要求较为苛刻， 普通培养条件下在常规培养基上生长困难或根本不生长的一类细菌必备条件特殊的选择性培养基如加入血液的平皿特殊的生长环境：CO2孵箱足够的培养时间 2-7天，或更长时间 技术人员对菌落的识别、鉴别,2018/4/24,71,苛养菌培养注意问题,2018/4/24,72,链球菌,2018/4/24,73,寄居在人的上呼吸道中，是大叶性肺炎、支气管肺炎的病原菌。肺炎链球菌的侵袭力主要是荚膜，失去荚膜其毒力减弱或丧失。,2018/4/24,74,肺炎链球菌,肺炎链球菌,2018/4/24,75,2018/4/24,76,肺炎链球菌,溶血链球菌,A群化脓性链球菌，是引起化脓性感染的主要病原菌，致病力最强，可引起痈、蜂窝织炎、急性咽炎、丹毒、脓疱疮、猩红热、医源性伤口感染和产后感染等。B群无乳链球菌，定居人体肠道和阴道，带菌率30%，鼻咽部也携带此菌。可引发新生儿败血症、肺炎、脑膜炎等。,2018/4/24,77,菌落特点,2018/4/24,78,ACG群,F群,B群,2018/4/24,79,主要鉴定方法,2018/4/24,80,菌落特点：菌落大小，溶血环特点CAMP试验、 杆菌肽、SXT 乳胶凝集试验vitek GP卡、MS,CAMP 杆 SXTA 群 - S RB 群 + R R非A.非B R S,2018/4/24,81,BA,SXT,嗜血杆菌,2018/4/24,82,Hin： 在呼吸道定植率可达人群的50%，主要 寄 生于 咽喉及口腔粘膜， 主要引起人类 急性化脓性感染及继发感染Hpi：为上呼吸道正常菌群 偶可引起心内膜炎、尿道炎,流感嗜血杆菌,2018/4/24,83,在含5-10%CO2环境中生长良好 HIN需X+V因子才能生长血中2个因子都有，但 X因子：血红蛋白衍生物，对热稳定。V因子：辅酶I或辅酶，对热不稳定，常处于抑 制状态。加热80-90，才能释放出来 血液加热后成为巧克力色巧克力平皿生长,流感嗜血杆菌,2018/4/24,84,卡他莫拉菌,2018/4/24,85,被认定为是有临床意义的条件致病菌,肺炎支气管炎脓胸菌血症,中耳炎结膜炎脑膜炎心内膜炎,卡他莫拉菌,2018/4/24,86,为 G-双球菌，肾形成对排列专性需氧菌 菌落：不透明、鼓起、光滑或亚光，颜色乳白、 粉红或褐色。特点：可平移，易碎、段切。,卡他莫拉菌,2018/4/24,87,主诉：反复咳嗽，咳黄脓臭痰8个月，咯血7个月起因：淋雨受凉无发热既往体健病初抗生素治疗有效（LEV无效，换头孢唑肟3w）黄色脓痰（100ml/d）间断咯血无发热,2008-4,病 例,89,入院时（08-12）,感染？细菌？结核？真菌？肿瘤？血管炎？,90,实验室检查,血尿常规 (-)，血CRP 13.7mg/dl，ESR 44mm/hr感染：结核：结核抗体(-), 痰抗酸染色(-)痰细菌涂片：G-杆菌，G-球杆菌； 真菌：痰真菌涂片、 G因子、GM试验（-） 免疫疾病ANA+抗ds-DNA（-）；cANCA 1：20（+），PR3-ANCA 22RU/ml复查cANCA 1：40（+），PR3/MPO-ANCA（-）,病原学检查涂片：可见细胞内吞噬大量G+杆菌，呈分枝状，不产芽孢，呈现多形性，G+球菌成堆，G-球菌可见 ；真菌涂片、抗酸染色（-）、弱抗酸（-）；厌氧培养：衣氏放线菌中间普雷沃菌（拟杆菌）产黑素普雷沃菌消化链球菌属,治疗：莫西沙星+哌拉西林/他唑巴坦+甲硝唑 静脉莫西沙星+阿莫西林/克拉维酸+甲硝唑 口服,93,2018/4/24,肺放线菌病的临床特点,常因受凉、劳累后起病。也多见于酗酒，误吸的患者。易误诊为肿瘤、结核、真菌、奴卡菌。肺放线菌病可以比较“温和”，可以是较长的病程。常与其他病原体共同感染导致复杂或不典型的临床表现。可以是肺脓肿也可以是支气管炎。,2018/4/24,94,2018/4/24,95,肺放线菌病很少见吗？,放线菌的多变性,2018/4/24,96,培养条件：厌氧或微需氧。对于需氧培养可以生长的放线菌又常常不会想到用厌氧菌鉴定