广西地方标准《鸭圆环病毒的鉴别检测聚合酶链式反应法》征求意见稿

ICS11220B41DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXXXXX鸭圆环病毒的检测聚合酶链式反应法THEIDENTIFICATIONOFDUCKCIRCLEVIRUSBYPCR（征求意见稿）（本稿完成日期2017年11月30日XXXXXXXX发布XXXXXXXX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXXXXXI目次前言III1范围12规范性引用文件13术语和定义14生物安全措施15防污染措施26试剂与材料27操作方法38结果判定5附录A（规范性附录）引物序列及检测结果判定6附录B（规范性附录）溶液的配制7附录C（规范性附录）本标准词汇中英文对照表9DB45/TXXXXXXXXII前言本标准按照GB/T112009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人粟艳琼、郑敏、尹彦文、张步娴、莫胜兰、屈素洁、邹联斌、胡杰、施开创、李军。DB45/TXXXXXXXX1鸭圆环病毒的检测聚合酶链式反应法1范围本标准规定了应用聚合酶链反应法检测鸭圆环病毒（DUCKCIRCOVIRUS，DUCV）的生物安全措施、防污染措施、试剂与设备、操作方法、及结果判定。本标准适用于鸭圆环病毒（DUCKCIRCOVIRUS，DUCV）的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31鸭圆环病毒DUCKCIRCOVIRUS鸭圆环病毒（DUCKCIRCLEVIRUS，DUCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，无囊膜，单股环型DNA结构。主要是侵害宿主的免疫系统，而导致宿主免疫力低下，进而引发二重或多重感染，可给养殖业造成极大经济损失。然而由于鸭圆环病毒发现较晚，又缺乏体外培养鸭圆环病毒的方法，因此对其致病机理及危害的研究尚存在很多困难。32聚合酶链式反应POLYMERASECHAINREACTION简称PCR，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。33引物与待扩增DNA片段两侧互补的一小段寡核苷酸。4生物安全措施实验室人员的安全，应在具备检测鸭圆环病毒的生物安全实验室（兽医生物安全二级以上实验室）以及具备相应为了保护实验室人员的安全，应由具备相应资质的工作人员检测鸭圆环病毒，所有废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。DB45/TXXXXXXXX25防污染措施防止污染的采样和检测措施应符合NY/T541的规定。6试剂与仪器设备61试剂611特异性引物特异性引物引物序列见附录A中的A1。上、下游引物的使用浓度均为25PMOL/L。612DNA抽提试剂盒DNA抽提试剂盒主要成分如下细胞裂解液；氯仿；异丙醇；无水乙醇；75乙醇；洗脱缓冲液；DEPCH2O；过滤柱。613PCR试剂盒PCR试剂盒主要成分如下2TAQPCRMASTERMIX；DEPCH2O；614电泳试剂电泳试剂如下DL2000DNAMARKER琼脂粉10000DNA染料凝胶加样缓冲液；1TRIS硼酸电泳缓冲液。注注配制方法按附录中的B4。615其他试剂其他试剂如下1MOL/L灭菌PBS（PH72）；DEPCH2O。注注配制方法按附录中的B2、B3。616一次性耗材DB45/TXXXXXXXX3本方法使用下列一次性耗材乳胶手套；离心管；PCR反应管；吸头。62仪器设备本方法使用下列仪器设备PCR仪；电泳仪；凝胶成像系统；高速台式冷冻离心机；小型高速离心机；水浴锅；乳钵或玻璃研磨器；微量加样器；冰箱。7操作方法71待检样品处理711组织样品无菌采取待检鸭的肝、肾、脾、肺、法氏囊等器官组织样品各约2G，置于乳钵或玻璃研磨器中，充分研磨后，加入1ML无菌PBS；收集组织悬液反复冻融3次后，以3000R/MIN4离心5MIN，收集上清，供总DNA提取用，或置20保存备用。72待检样品总DNA提取取经处理的待检样品上清200L置于无RNA酶的15ML离心管中，按照DNA提取试剂盒操作说明书抽提总DNA。直接取总DNA作为模板进行PCR，或置20保存备用。73PCR检测731PCR扩增反应液总量25L。在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成分2TAQPCRMASTERMIX125L；上游引物（25PMOL/L）05L；下游引物（25PMOL/L）05L；待检总DNA模板55L；DEPCH2O6L。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，反应程序为94预变性3MIN；9440，6030，722MIN，共35个循环；72延伸7MIN。PCR产物直接用于电泳，或置4保存备用。DB45/TXXXXXXXX4732阴性及阳性对照7321阴性对照用55LDEPCH2O代替总DNA为模板作阴性对照模板。7322阳性对照取鸭圆环病毒重组质粒3L作为PCR阳性对照模板。74电泳74112琼脂糖凝胶制备将凝胶托架水平放置在工作台上，放上梳子，使梳齿下沿距离托架底板05MM10MM。配制100ML的12凝胶称取12G琼脂糖，加入100ML1TRIS硼酸电泳缓冲液，煮沸溶解琼脂糖。待琼脂糖溶液冷却至约50时，加入10000DNA染料10L，充分混合，避免起泡。倒入凝胶托架，把凝胶厚度控制在3MM5MM之间。待凝胶充分凝固后，将凝胶连同托架一起放入电泳槽中，加入1TRIS硼酸电泳缓冲液，使之没过凝胶表面约2MM，轻轻拔出梳子，以备加样电泳。742加样将5LPCR产物加至琼脂糖凝胶样品孔中。同时设置DL2000DNAMARKER标准加样孔作为对照。743电泳条件以80V100V稳压电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端2CM3CM时停止。75注意事项751本操作程序应在一个无RNA酶的环境下进行，整个操作过程宜在超净工作台中进行，并使用一次性乳胶手套。752离心管、PCR反应管、加样吸头应使用一次性塑料制品，使用前均应经DEPCH2O处理或直接购买无RNA酶产品，然后进行1034105PA高压灭菌30MIN。753注DEPC处理水的制备方法按附录B3。8结果判定81将电泳后的琼脂糖凝胶用凝胶成像系统观察并拍照。阴性对照无任何DNA扩增带，而阳性对照在408BP位置出现DNA扩增带，则试验结果成立。82若被检样品在408BP位置出现DNA扩增带，判定为鸭圆环病毒阳性；注1注鸭圆环病毒PCR产物凝胶电泳结果见附录A2。DB45/TXXXXXXXX5AA附录A（规范性附录）引物序列及检测结果判定A1鸭圆环病毒特异性引物寡核苷酸序列引物序列见表1。表1鸭圆环病毒特异性引物序列引物名称引物序列（53）片段大小BPDUCKAF5MGAGCTGCCGCCCTTGAG3DUCKAR5TCCCGAGTAACCGTCCCACCAC3408A2鸭圆环病毒PCR产物琼脂糖凝胶电泳图PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1。图1鸭圆环病毒PCR产物琼脂糖凝胶电泳图MDNA分子质量标准；1408BP片段的PCR产物；2阴性对照FIG1AMPLIFIEDFRAGMENTSOFDUCVBYPCRMDL2000DNAMARKER；1PCRPRODUCTOF408BP；2NEGATIVECONTROLDB45/TXXXXXXXX6BB附录B（规范性附录）溶液的配制B1试剂本附录所用试剂均为分析纯。B2PBS配制1MOL/LPBS（PH72）配制方法如下氯化钠8G；氯化钾02G；磷酸氢二钠144G；磷酸二氢钾024G；双蒸水定容至1000ML。在800ML的双蒸水中依次加入其余成分，用1MOL/L盐酸调节溶液的PH值至72，加双蒸水定容至1000ML，1034105PA高压灭菌25MIN。室温保存。B3凝胶加样缓冲液的配制凝胶加样缓冲液配制方法如下蔗糖40G；05MOL/LEDTAPH8020ML；10SDS5ML；溴酚蓝50MG；双蒸水75ML。先将蔗糖完全溶解于双蒸水，然后按顺序加入其余各成分，待所有成分溶解并混合均匀后，用022MM的微孔滤膜过滤除菌。4保存。B4三羟甲基氨甲烷（TRIS）硼酸电泳缓冲液的配制B4115TRIS硼酸电泳缓冲液的配制5TRIS硼酸电泳缓冲液配制方法如下TRIS54G；硼酸275G；05MOL/LEDTAPH8020ML；双蒸水定容至1000ML。在800ML双蒸水中加入54GTRIS、275G硼酸和20ML05MOL/LEDTAPH80，磁力搅拌以确保其完全溶解，然后定容至1000ML，移至棕色瓶中。室温保存。DB45/TXXXXXXXX7B421TRIS硼酸电泳缓冲液的配制1TRIS硼酸电泳缓冲液配制如下5TRIS硼酸电泳缓冲液100ML；双蒸水400ML。在400ML双蒸水中加入100ML5TRIS硼酸电泳缓冲液，混匀。室温保存。DB4