肝炎的分子诊断与临床应用PPT课件

,肝炎分子诊断项目开展介绍,目 录,1、了解肝炎分子诊断2、分子诊断在HBV中的临床应用3、分子诊断在HCV中的临床应用4、ADICON已开展的肝炎分子诊断项目,我国乙肝病毒感染率概况,20062010年全国乙型病毒性肝炎防治规划显示，中国是乙型肝炎病毒感染和发病人数最多的国家，全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒。目前全国慢性乙肝病人2000万人，每年死于与乙肝相关的肝病患者达28万例，发病率和死亡率都位居前三位。每年造成的直接经济损失约达3600亿元人民币。,我国乙肝病毒感染率概况,什么是分子诊断,在临床上应用核酸（DNA/RNA) 和分子生物学技术, 在基因水平诊断和监控疾病情况和疗效，评估疾病的检测方法。,分子技术在乙肝诊断与治疗中应用,高灵敏度乙肝DNA检测,高精度病毒载量检测系统（ COBAS AmpliPrep/Cobas TaqMan ）,高灵敏度乙肝DNA检测优势,定量PCR技术检测患者的血清HBVDNA含量，能更准确地反映病毒复制程度，对HBV相关疾病的诊断、治疗、判断预后意义重大。QF-PCR是国内常用的定量检测血清HBVDNA水平的方法，COBAS 系统是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于血清HBVDNA定量检测的方法。它具有灵敏度高，线性范围广，实时监控，重复性好，可检测A、B、C、D、E、F、G、前C区变异等多基因型DNA载量优点。由于本QF-PCR试剂盒的线性范围为1.0x 103 copiesmL1.0x 108 copiesmL，对于低于1.0 x 103 copiesmL标本的检测结果不能给出具体拷贝值，有存在漏检的可能。 而COBAS 系统线性范围为20-1.7108 IU/mL，因此， COBAS 系统更能准确反映血清HBV DNA含量。,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0,Cobas,高灵敏度乙肝：20 IU/mL,准确判断治疗起点/终点,线性范围乙肝：20-1.7108 IU/mL,极佳的重复性，结果可靠正确指导抗病毒治疗,每批试剂均使用WHO标准品校准,保证定量结果的准确性和可溯源性,每个样本使用同源性内标定量,避免结果不准确,采用AmpErase酶,减少交叉污染,目前在国内唯一满足治疗指南和专家共识的HBV DNA和 HCV RNA检测试剂,HBV DNA 监测的重要性 口服核苷（酸）类似物疗效评估,部分病毒学应答60 2,000 IU/mL加其他药物治疗每3个月监测HBV DNA,*Keefe, E. Clin Gastro Hepatology. 2007; (5):890-897.,抗病毒治疗应将HBV DNA降至尽可能低的浓度，理想是低于实时定量 PCR方法（灵敏度10-15 IU/mL）的最低检出限1 1. EASL HBV Guidelines. J Hepatology. 2009;50:277-242,CHB疾病管理:治疗目标,HBsAg清除及血清学转换,治疗终点,ALT正常,组织学改善,HBV DNA降低/消失,HBeAg血清学转换,HBeAg消失,cccDNA 清除,*Lok, A.S.F et.al. “Chronic Hepatitis B: Update 2009.” HEPATOLOGY, Vol 50, No. 3, 2009, pgs 8-9,治疗终点,2009年EASL指南提出的治疗终点：最理想的治疗终点：持续的HBsAg 消失，伴或不伴抗HBs 抗体出现。满意的治疗终点：在HBe Ag 阳性患者中，出现持续的HBeAg 血清转换次级的满意治疗终点：尽可能降低病毒DNA水平（降至实时定量 PCR检测限以下：10-15IU/ml）,HBV基因分型,根据HBV全基因核苷酸序列的差异，分为不同基因型:A.B.C.D.E.F.G.H共8个型 不同的基因型具有不同地域分布 我国主要是BC型为主，偶有A型 北方C型,HBV基因分型检测临床意义,HBV变异的基础,乙肝病毒:高变异性 1/105 24h 一万亿-十万亿拷贝*变异：一千万一亿复制过程:DNA-RNA-DNAHBV逆转录酶:缺乏严格的校正机制变异:自然变异,免疫压力等等,P区耐药位点检测,HBV病毒耐药性检测,长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区原因：抗病毒药物作用在病毒P区药物靶点上，引起相关基因变异，使得药物与相关靶点作用下降，进而产生耐药。,抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药,原发无应答,病毒学（部分）应答,临床耐药,抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药,病毒耐药的临床影响,耐药病毒的出现使后续治疗的药物疗效降低 耐药病毒的出现抵消了之前获得的临床益处病毒反弹, 血清转氨酶升高, HBeAg血清转换率降低肝脏病理进展肝硬化病人出现肝功能失代偿和死亡肝移植后肝炎复发率增高 公共卫生危害耐药病毒株的传播免疫逃逸,Liaw et al. 1999. Hepatology 30: 567,病毒的水平越低，耐药发生的几率越低,初治患者耐药发生率,拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦为基因型耐药发生率,替比夫定为因耐药发生的病毒学反弹发生率,P区耐药位点检测,长期使用抗病毒药物可引起HBV耐药，引起耐药的基因突变位点主要集中于P区耐药基因分析在临床药物选择上的应用 目前最常见P区耐药位点11个（169、173、180、181、184、194、202、204、233、236、250）,拉米夫定 M204I/V L180M V173L 恩曲他滨 V173L L180M M204I/V 阿德福韦 A181V N236T 恩替卡韦 T184A（G/I/S) M250V 特比夫定 M204I/V,常用抗病毒药物的耐药位点,常见变异的交叉耐药性,敏感,界于中间,耐药,抗病毒药物的选择和使用,1.一种药物产生耐药时，需要用具有不同耐药位点药物代替2.为减少耐药情况，建议从治疗开始就使用具有两种不同耐药位点药物一起治疗3.由于抗病毒药物的耐药以及治疗的长期性，在治疗过程中应该定期检查，或是在发现药物治疗效果不佳时需排除产生耐 药的可能,药物治疗慢性乙肝患者管理路线图,检测,检测,检测,检测,耐药检测项目,目前检测的变异位点： P区耐药位点11个（169、173、180、181、184、194、202、204、 233、236、250）专门检测LAM变异位点：180，181，204，173专门检测ADV变异位点：181，233，236,艾迪康医学检验中心P区基因变异检验报告单样张,丙型肝炎病毒,传播途径:主要血液/体液传播(似HBV)是引起输血后慢性肝炎和肝硬化主要原因无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上免疫力不牢固,黄病毒科 丙型肝炎病毒属球形有包膜的RNA病毒，直径50nm病毒基因为单股正链RNA，链全 长约10Kb,HCV RNA 检测,确定