解淀粉芽孢杆菌B9601Y2对玉米的防病促生长效果研究

玉米科学2015，23(51：153158 Journal of Maize Sciences 文章编号：1o050906(2015)05015306 DOI：1013597cnkimaizescienee20150526 解淀粉芽孢杆菌B960 1-Y2对玉米的 防病促生长效果研究 崔文艳 ，何朋杰 ，尚 娟 ，李艳云 ，吴毅歆 一，何月秋 。 (1云南农业大学植物保护学院，昆明650201；2微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心，昆明650207； 3云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201) 摘要：通过平板对峙培养及盆栽试验，研究解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2(Y2)防治玉米小斑病和茎基腐病以及 提高玉米生物量的效果。平板对峙培养结果表明，Y2发酵液、无菌滤液及菌体悬液对玉米小斑病菌和茎基腐病原 菌均有拮抗作用。盆栽实验结果显示，3种处理对玉米小斑病防效60左右，对茎腐病防效50左右，防效依次为 Y2发酵液菌体悬液无菌滤液。单独使用Y2发酵液、无菌滤液及菌体悬液处理的苗根长、株高、鲜重和干重均显 著高于清水和病原菌对照20以上，喷施或灌溉接种病原菌的玉米苗生长量显著高于单独接种病原菌处理，有效消 除了病原菌对植株生长的影响。因此，生防菌Y2具有用于防治玉米病害和具有根肥及叶面肥的潜力。 关键词：玉米；生防菌；拮抗；小斑病；茎基腐病 中图分类号：$435131 文献标识码：A Effects of Bacillus amyloliquefaciens B960 1-Y2 on Diseases ControI and G rowth-promotion of Maize CUI Wenyan 一，HE Peng-jie ，SHANG Juan ，LI Yan-yun ，WU Yi-xin ，HE Yue-qiu ， (1Faculty ofPlant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201； 2National and Local Joint Engineering Research Centerfor Screening and Application ofMicrobial Strains,Kunming 650207； 3Faculty ofAgronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201，China) Abstract：By dualculture confrontation assay(DCA)and pot culture test，to study the effect of Bacillus amylo liquefaciens B9601一Y2(Y2)to control southern leaf blight(SLB)and stalk rot and increase biomass of maizeDCA showed that formulate suspension(FS)，cellfree fihrate(CF)and cell suspension(CS)of Y2 could inhibit mycelial growth of Bipolaris maydis and Fusarium verticillioidesPot culture test indicated that those suspensions could COn trol over 60of SLB and over 50of stalk rot with the tendency FSCSCFThose suspensions promoted over 20of root length，plant type height，dry weight of aboveground and dry weight of under-ground for healthy maize and for the disease seedlings inoculated with Bmaydis and verticillioides by spray or drenchingThereforeY2 has the potential serving as a root and leaf biofertilizer with disease control effect for maize Key words：Maize；Biocontrol agent；Antagonism；Southern leaf blight；Stalk rot 玉米是我国主要粮食作物，病害是影响玉米产 收稿日期 基金项目 作者简介 2Ul5-03-06 科技部国际合作项目(2009DFA32360)、云南省玉米产业 体系项目 崔文艳(1988-)，女，云南昭通人，硕士，主要从事植物病 害生物防治研究。TelEmail：2276612334qqcom 何月秋为本文通讯作者。Email：ynfh2007163corn 量和品质的主要因素之一。小斑病和茎基腐病是我 国危害大、分布广且逐年加重的主要玉米病害。防 治上主要依靠化学农药，但长期大量使用化学药剂 会带来一系列问题n ，如化学药剂残留、有害生物产 生抗药性、有益微生物数量减少、污染环境，破坏生 态平衡，因此，采用新型的防治策略迫在眉睫 。生 物防治因具有环境友好且可持续等特点，已成为当 今研究的热点领域。 B9601一Y2(Y2)是本实验室分离的专利菌株(专 玉米科学 23卷 利号：ZL2003101041956)，隶属于解淀粉芽孢杆菌植 生亚种(Bacillus amyloliquefaciens subspplantarum)， 具有促进种子萌发和植物的扦插生根、提高作物出 苗率、加快植物生长等特点p 。全基因组测序以及 MALDITOFMS发现，Y2可以分泌伊枯草菌素、丰 齐素和聚酮类抗生素 ，也能拮抗纹枯病菌(Rhizocto nia solani)、油菜核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum1、炭疽 病菌(Colletotrichum spp)以及灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等多种常见病原真菌 】。本文通过研究Y2对 玉米小斑病菌和茎基腐病菌的室内平板拮抗效果以 及在玉米盆栽实验中的防病促生表现，为将其生产 成控病、减肥增效的玉米微生物肥料提供实验依据。 1材料与方法 11供试材料 菌株包括玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米 茎基腐病菌【轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、Y2 均由本实验室分离和保存。玉米品种禾玉一号，由 云南禾益种业有限公司生产。 培养基包括PDA培养基、LB培养基和玉米培养 基(玉米种子200 g浸泡12 h，煮沸至开裂后滤去玉 米种子，收集其浸出液，加入蔗糖10 g，加水补足至 1 000 mL，120C灭菌30 min)。 12试验方法 121 Y2的发酵液及滤液对玉米小斑病菌与轮枝 镰孢的抑菌率测定 将病原菌与Y2活化备用。挑取Y2单菌落转接 入新鲜无菌液体LB培养基中，37，170 rrain振荡 培养72 h，获得Y2发酵液；12 000 dmin，4离心 12 min，022 m细菌过滤器过滤，收集无菌滤液；无 菌生理盐水洗涤悬浮菌体沉淀4次，最后加入适量 的生理盐水将菌体浓度调整至3xlO cfumL(下称菌 体悬液)，备用。用5 mm打孔器在已活化的病原菌 菌落边缘打取菌饼，并转接人新制备的PDA平板中 央，分别用移液器吸取1 IxL发酵液及无菌滤液，点 接于距菌饼中心3 cm处，28培养37 d。以纯培 养病原菌的PDA平板为空白对照(CK)，每个处理重 复3次，测量抑菌带宽度 ，计算Y2对小斑病菌和轮 枝镰孢的抑菌率。 122 Y2对玉米茎基腐病防治试验 轮枝镰孢分生孢子液的制备：挑取轮枝镰孢的 菌丝块，分别转接入玉米种子培养基，28，160 rrain 振荡培养7 d，无菌擦镜纸过滤，收集孢子悬浮液并 血球计数板观察计数，测算出滤液的分生孢子浓度， 备用。 盆栽实验：将自然土和漂浮育苗基质按质量比 4：1比例均匀混合，用作玉米盆栽。将盆栽用土分 别设如下处理：空白对照(清水)；Y2发酵液f菌体含 量310cfumL)；Y2无菌滤液；菌体悬液。按每盆 50 mL与土壤(350 g土盆)均匀混合，放置48 h后，按 1 o5个g土壤的病菌孢子用量加入病原菌。均匀混 合后，等量分装人营养盆(直径13 cm高12 cm1中。 每盆播人5粒经1NaC10消毒且室温催芽72 h的 玉米种子后，表面覆土。每个处理设4次重复，按常 规水肥管理。同时，玉米幼苗出土4周后，开始调查 玉米植株病情、型高f从茎基至最长叶尖的长度)、根 长、鲜重以及干重等生物量。病情调查时，观察玉米 茎基部或茎节是否变褐或茎节是否变软，并拔起植 株用流水洗净根部观察玉米根部发病情况。按参考 文献f71中的05级方法调查病情。 123 Y2对玉米小斑病防治试验 小斑病菌分生孢子液的制备，除001的吐 温一80调整孢子浓度外，其余程序参见轮枝镰孢孢 子液制备。 待玉米生长至3叶1心期后，采取4个处理：Y2 发酵液f菌体含量310 cfumL)；Y2无菌滤液；Y2 菌体悬浮；空白对照(清水)。每个处理设5次重 复。48 h后，再向玉米植株叶片上喷接孢子浓度为 4xl 4 cfumL的小斑病菌分生孢子悬浮液。各处理 喷施量以玉米叶面湿润不下滑为度。接种病菌后， 将玉米苗置于25，相对湿度80，保持48 h。接种 病菌2周后，调查病情和玉米植株的型高、根长、鲜 重以及干重等生物量，病情具体分级标准、发病率、 病情指数和防效参照文献【8】的方法。 2结果与分析 21 Y2对玉米小斑病菌及轮枝镰孢的拮抗效果 室内平板对峙培养结果如图1所示，Y2对玉米 小斑病菌、轮枝镰孢具有较强的抑制效果，抑菌带宽 度分别为62 mm和73 mm，抑菌率分别为6647和 6905。 22 Y2发酵液、无菌滤液和菌体悬液对玉米小斑 病菌和轮枝镰孢抑菌率 Y2发酵液、无菌滤液和菌体悬液对玉米小斑病 菌及轮枝镰孢有较强抑制作用(表1)。其中，对玉米 小斑病菌抑制率分别为6716，5556和6042； 对轮枝镰孢的抑制率分别为6944、4508和 6031。以Y2发酵液对2种病原真菌的生长抑制 作用最为明显，菌体悬液次之，无菌滤液的抑菌效果 最差 156 玉米科学 23卷 232 Y2提高玉米植株农艺性状的效果 在玉米播种后的第30天调查病害的同时，测量 玉米的出苗率、型高、根长(表3)、鲜重及干重(表4)。 无论是不接种病菌的处理，还是接种病菌处理，使用 Y2的处理，其玉米各项农艺性状均较不施用Y2的 植株更具优势，即Y2有显著促进玉米植株生长和消 除病害对玉米的伤害作用。 在未接种病原菌的条件下，Y2发酵液、无菌滤 液、菌体悬液与不使用Y2的空白对照清水f处理9) 相比，玉米根长分别增加3556、2885和2348， 型高分别增加4045、3045和2703；地上部鲜 重分别增加3274、2960、2422，干重增加 3297、2967、2418；地下部鲜重分别增加 79O2、5944、4965；干重分别增加7925、 5849、4906。 单独使用小斑病原菌(处理11和茎基腐病原菌 (处理5)的处理，其玉米的根长分别比空白对照清水 (处理9)减少044、116；与空白对照清水(处理91 相比，接种玉米小斑菌和茎基腐病菌的玉米地上部 鲜重分别减少1076、987；地下鲜重分别减少 490、420；tg上部分干重分别减少989、879； 地下部干重分别减少566、377。 表3 Y2对玉米的根长和型高的影响 Table 3 The effect of Y2 O1“1 maize root length and type height 处理 根长 比CK增长 型高 比CK增长 处理 根长 比CK增长 型高 比CK增长 Treatment (cm) () (cm) () Treatment (cm) () (cm) () Root length Increase Type height Increase Root length Increase Type height Increase l 2909234 f 一044 4284133 f 954 7 3O72112 e 513 4165_+084 g 6-49 2 3757(】98 h 2858 5118053 b 3086 8 3120122 fe 678 4293103 f 977 3 3O83_+052 e 551 4444127 e l363 9 2922128 f 391l0-89 i 4 3345_+092 d 1448 44882_33 de 1475 lO 3961066 a 3556 5493050 a 4045 5 2888064 f 一116 4027125 h 297 l1 3765059 b 2885 5 102037 b 3045 6 3274123 d 12O5 4545070 d 162l l2 36O8057 e 2348 4968_+062 C 27O3 注：处理14接种小斑病菌处理(处理1为小斑病菌对照，24分别为接种小斑病菌处理加Y2发酵液、加Y2无菌滤液、加Y2菌体悬液处 理；处理58接种茎基腐病菌处理f处理5为茎基腐病原菌对照，68接种茎基腐病菌处理加Y2发酵液、加Y2无菌滤液、加Y2菌体 悬液处理；处理9清水；1012单独Y2发酵液、单独Y2无菌滤液、单独Y2菌体悬液处理。下表同。 Note：Treatments14：inoculation with Bmaydis，among them，Treatment1，with Bmaydis only，Treatments24：CF，CS，FS of Y2；Treat ments15：inoculation with Fverticillioides，among them，Treatment5，with Fverticillioides only，Treatments6-8：CF，CS，FS of Y2； Treatment9water；Treatments1012：CF。CS，FS ofY2The same below Y2发酵液、无菌滤液及菌体悬浮液均能消除病 原菌对玉米生长的影响，增加生物量，植株长势优于 接种病原菌的处理，也优于不接种病菌的空白对照 清水(处理9)。接种小斑病病菌后，使用Y2的3种处 理的植株分别较病株根长增加了2915、598、 1499；型高增加了1947、373、476；地上部 分鲜重增加4623、1 809、2965，干重分别增加 4512、1707、2927。接种轮枝镰孢后，使用 5期 崔文艳等：解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2对玉米的防病促生长效果研究 157 Y2的3种处理液植株分别较病株根长增加1337、 637、803；型高分别增加1286、343、 661；地上部鲜重增加3682、2338、2687；干 重分别增加3614、2289、2651；地下部鲜重分 别增加4599、1971、2847；干重分别增加 4510、1961、2745。 表4 Y2对玉米鲜重、干重的影响 Table4 The effect ofY2 onmaizefresh and dryweights 3结论与讨论 生物防治主要是利用微生物生命活动来抢占生 态位点、竞争营养、分泌次生代谢产物等达到增产、 抗病的效果 1。采用具有促生长和防病功能的菌株 既能保证增产，又能减少化肥用量，节约生产成本， 还能改良土壤及改善作物品质，减少环境污染。目 前已有很多关于使用微生物菌剂防治作物病害的报 道u “1，利用生防菌及其代谢产物调控寄主植物根 际益害微生物的平衡从而达到控病保产的目的，是 防治土传病害的重要途径。Y2能内生定殖于玉米 植株体内，当生防菌定殖数量达到一定水平时，生防 菌同病原菌的营养竞争、生态位竞争具有优势，产生 足够的抗生物质，从而阻止病原菌对植株的侵染。 本研究中生防菌Y2对玉米小斑病及茎基腐病 具有良好的防治效果，其发酵液、无菌滤液和菌悬液 对两种病菌都有很好抑制结果，其中，发酵液效果最 优，菌体悬液(仅有Y2细菌的生理盐水悬液)次之，无 菌滤液略差。在玉米盆栽防病实验中，无论使用Y2 发酵液，无菌滤液还是菌体悬液浇灌或喷施，都能够 有效降低茎腐病及小斑病的发病指数，具有很好防 效，这可能与Y2产生了大量次级代谢产物抑制了病 原菌孢子的萌发、菌丝生长，从而对病原菌产生拮抗 作用有关。从玉米的生长量上来看，Y2不仅能对病 害有防治效果，还能消除病害对植株生长的影响，从 而增加植株的生物量；Y2发酵液、无菌滤液及菌体 悬浮液均对玉米生长有促进效果，其中，发酵液效果 优于菌体悬液，菌体悬液效果又优于无菌滤液，这可 能与Y2发酵液中也有次生代谢产物有关 ，如IAA、 赤霉素、细胞分裂素等，促进了植物的生长。 生物防治是植物病害防治的一种发展趋势，利 用芽孢菌作为生防制剂防治作物病害具有重要意 义，其减少了由于长期使用农药与化肥给人类及环 境带来的威胁，为农业的绿色可持续发展奠定了基 础，本试验中的拮抗菌Y2具有开发为生物肥料或生 物农药的潜能，其促生长及防病机制需进一步研究。 参考文献： 【1马佳，范莉莉，傅科鹤，等哈茨木霉SH2303防治玉米小斑病 的初步研究【jJ中国生物防治学报，2014，30(1)：79-85 Ma J，Fan L L，Fu K H，et a1The preliminary study on the control of southern corn leaf blight by Trichoderma harzianum SH23031 Chinese Journal of Biological Control，2014，30(1)：7985(in Chi nese) 2李晶，杨谦生防枯草芽孢杆菌的研究进展J1安徽农业科 学，2008，36(1)：106-111，132 Li J，Yang QResearch progress on biocontrol bacill US subtilisJ Journal of Anhui AgriSei，2008，36(1)：1061 1 1，132(in Chinese) 【3刘拴成，杨进成，马丽华，等解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2提高玉 米生长和产量的效应【JJ玉米科学，2010，18(6)：7882，85 Liu S C，Yang J C，Ma L H，et a1Effect of Bacillus amyloliquefa ciens B9601一Y2 on growth and yield promotion of 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