枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

第33卷第2期 2012年4月 华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University VoL 33No2 Apr2012 枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的 克隆及功能验证 贾 凡H，毛自朝H，王志远 ，赵 静 ，吴毅歆 ，何月秋 ， (1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201： 2云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心，云南昆明650201) 摘要：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株为探 明其高效的蔗糖代谢机制，用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖一6一磷酸水解酶基因(XFsacA基因)， 其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97的相似性，且发生了l2个氨基酸 突变将该基因中约14 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上，构建了重组表达质粒pQE30一XFsacA，该质粒 转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BI21中，后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长，并 表达出了一条约54 000蛋白条带结果预示XFsaeA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础，同 时XFsacA基因的克隆与其在Ecoli中的表达研究，为利用蔗糖发酵的工程Ecoli构建奠定了基础 关键词：枯草芽孢杆菌XF1；蔗糖；代谢；基因克隆 中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1001411X(2012)02015405 Cloning and Functional Confirmation of XFsacA Gene from Bacillus subtilis XF1 JIA Fan”，MAO ZichaoH，WANG Zhiyuan ，ZHAO Jing ，WU Yixin ，HE Yueqiu ， (1 Facuhy of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China； 2 National Engineering Center of Agricultural Biodiversity for Applied Technology， Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China) Abstract：Bacillus subtilis XF1，which is patented and a very efficient biocontrol agent to control clubroot disease of cruciferous crops，grows very quickly when sucrose is used as carbon sourceTo elucidate the growth promotion mechanism of sucrose，the XFsacA gene，encoding a key enzyme for sucrose metabo lism，was amplified by PCR and sequencedIts amino acid sequence has 97homolog to Bacillus subti lis B168 except 12 amino acids replacementThe coding region of the gene was inserted into plasmid pQE30 to construct an expression plasmid，pQE30一XFsacAAfter pQE30-XFsacA was transformed into Escherichia coli BL21，which could not use sucrose，a protein band about 54 000 detected by SDS PAGE analysis indicated the gene was successfully expressed in BL2 1The function of XFsacA gene was con- firmed by the transformed BL21 having the ability to grow and survive in M9 medium with sucrose as sole carbon sourceThe data indicated that the replacement of 12 amino acids of XFsacA in XF1 strain might ireprove the efficiency in use of sucrose，and cloning and functional expression of XFsacA in Ecoli could be a good strategy for developing metabolic engineered Ecoli strain to use sucrose 收稿日期：20110315 作者简介：贾 凡(1985一)，女，硕士研究生；毛自朝(1969一)，男，教授，博士；十对本文贡献相同；通信作者：何月秋 (1956一)，男，教授，博士，Email：ynth2007163con 基金项目：科技部国际科技合作项目(2009DFA32360)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201003029)；云南省自然科学 基金重点项目(2008CC024)；云南省科技强省专项(2009EB060) 第2期 贾凡等：枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证 155 Key words：Bacillus subtilis XF1；sucrose；metabolism；gene cloning 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1(下称XF1) 是云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程 中心分离于白菜根际土壤，对根肿病有较好防治作 用的生防专利菌株 J为研究其生物防治机制，XF1 菌株的基因组已被测序，目前正对该基因组进行组 装、注释和比较分析(相关数据另文发表)在对其发 酵条件及生物学特性的研究过程中，我们发现该菌 在含蔗糖的培养基中菌体生长快，形成菌落大这一 独特的碳源利用特性有别于枯草芽孢杆菌B168(下 称B168)、解淀粉芽孢杆菌植生性亚种Bamyloliq uefaciens subspplantarium B9601一Y2(下称Y2)为 研究其独特的蔗糖代谢机制，根据已测定的基因组 序列，我们预测了2个蔗糖利用的代谢途径，即以 sacB基因为主，催化蔗糖形成果聚糖和葡萄糖，以及 以sacA基因为主的催化蔗糖分解的代谢途径 J sacA基因与saeP基因组成一操纵子，其中sacP基因 参与磷酸烯醇式丙酮酸糖磷酸化转运系统(PTS)对 蔗糖转运 j，而sacA基因则编码蔗糖一6一磷酸水 解酶，催化蔗糖一6一磷酸水解为葡萄糖一6一磷酸 和果糖比较基因组分析发现XF1与B168蔗糖代谢 基因的结构及其调控相似，在含sacB基因的操纵子 (以下称sacB操纵子)中还含有levB基因(编码内切 果聚糖水解酶)和yveA基因(编码GluAap透性 酶)，而含sacP基因和sacA基因的操纵子(以下称 sacA操纵子)还包含有ywdA基因(编码一未知蛋 白)sacB及sacA操纵子的转录均受抗终止子sacY 基因和sacT基因的调控而含sacX基因和sacY基 因的操纵子(以下称sacX操纵子)受双组成信号因 子degS基因degU基因调控的同时也受sacT基因 和sacY基因自身的调节 为探寻XF1菌株对蔗糖的高效利用机理，本研 究首先利用本地Blast对B168和XFI基因组中的蔗 糖利用基因的编码蛋白序列及自起始密码子上游 300 bp的核酸序列进行比较分析，并对其中氨基酸 序列差异较大，编码蔗糖一6一磷酸水解酶基因(XF sacA基因)进行克隆和功能验证 1材料与方法 11材料 111 基因或基因组序列 Bacillus subtilis 168基 因组序列从GenBank(WWWncbinlmnihgov)或 Biocyc(WWWbiocycorg)数据库下载，而XF1基因 组由云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工 程中心(简称中心)测序并保存 112化学试剂蛋白胨、酵母粉、氨苄青霉素、葡 萄糖、蔗糖、其他的普通化学试剂，均购于国内外化 学药品试剂公司 113 XFsacA基因PCR引物根据XF1菌株基因 组中预测的XF sacA基因序列设计，由上海生工生 物工程公司(下称生工公司)合成，上游引物XF- sacAP1 r 5 GAAGATCT ATG ACAGCACATGACCAG GAG-5 ，含BglII位点和起始密码子ATG)，下游引 物XFsacAP2(5 一CCCAAGCTTCTACATAA GTGTC- CAAATYCC-3，含Hind HI位点) 114 质粒、菌株及分子生物学试剂PCR所用 Taq酶、dNTP、克隆载体pMD18T、限制性内切酶以 及T4连接酶均为TaKaRa公司产品，表达载体 PQE30购于德国Qiagen公司，B168菌株由德国洪堡 大学Borriss教授惠赠XF1菌株Y2菌株、克隆宿主 Escherichia coli JM109(下称JM109)及表达宿主E coli BI21(下称BL21)为中心保存其他DNA操作的 试剂盒均为生工公司产品 12方法 121 XF1菌株蔗糖代谢相关基因和注释及比较 分析下载B168中的蔗糖代谢相关基因，通过本地 Blast(2223+版本)对XF1基因组进行比较分析， 获取相似性最高且大于85的基因并命名(如XF sacA基因，为XF1中与B168菌株中sacA基因相似 性最高的基因)将编码基因翻译后进行本地BlastP 或DNAman比较获取氨基酸变异或替代信息；下载 各相似基因ATG上游的300 bp序列，用Blastn或 DNAman比较这些基因调控序列间的同源关系 122 XF1基因组DNA的提取活化XF1菌株， 挑单菌落接种于LB培养基中，3O，170 rrain震荡 培养1216 h，12 000 rmin离心收集菌体用于基因 组DNA的提取，提取方法参照Wilson 123 XFsacA基因的克隆 以基因组DNA为模 板，设计的sacAP1和sacAP2为引物，进行sacA基因 的PCR扩增PCR反应体系(总体系50 L)含：5 L 10ExTaq缓冲液，25 L 10 mmolL的dNTP，各1 L 50 mmoLL的引物，15ExTaqPCR反应条件： 94 oC 3 min，94 QC 1 min，55。I=45 S，7215 min， 25个循环；7210 minPCR扩增产物以琼脂糖凝 胶(8 L)电泳分离纯化，纯化后的产物与pMD18 T 156 华南农业大学学报 第33卷 载体连接，连接产物转入JM109感受态细胞中进行 蓝白斑筛选，挑取白斑经菌液PCR鉴定之后送生工 公司测序，并将所获质粒命名为pMDsacA 12。4重组表达质粒的构建提取pMDsacA质粒， 与表达载体pQE30同时使用限制性内切酶Bgl和 Hind进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，分离纯化 目的基因和表达载体；纯化后的产物用T4一连接酶 连接，连接产物转人JM109中转化子经PCR验证 125蔗糖一6一磷酸水解酶的诱导表达将空载 体(pQE30)及重组质粒(pQE30-XFsacA)转入表达宿 主BI21菌株中所获菌株pQE30BL21及pQE30 XFsacABL21在氨苄抗性的LB固体培养基平板上活 化后，次Et挑取单菌落接种于5 mL氨苄抗性的液体 LB培养基中，37，200 rrain，震荡培养过夜(1216 h)之后按体积比1：100转接于100 mL氨苄青霉素抗 性的液体LB培养基中，37 oC，200 rmin震荡培养，待 D伽 达到0406时，加入浓度为01 moLL的 IPTG至终浓度为1 mmolL，此时将温度调至30， 200 rmin震荡培养在诱导4 h后，取样做十二烷基 磺酸纳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析 126 XFsacA的功能验证使用含25 gL蔗糖的 M9液体培养基(17 g Na2HPO4、3 g KH2PO4、05 g NaC1、10 g NH C1，加水定容至1 L)分别培养经 IPTG诱导4 h，携带空载体pQE30及重组表达质粒 pQE30XFsacA的BL21菌株，定期取样监测菌体生 长及上清液中蔗糖含量变化菌体浓度采用分光光 度法测定D鲫 的变化，上清液中蔗糖的含量测定采 用蒽酮一硫酸法 2结果与分析 21 XF1菌株基因组中蔗糖代谢相关基因的注释 及与模式菌株Bsubtilis B168基因组的比较 分析 用B168基因组中蔗糖代谢相关基因序列为参 考序列，通过本地Blast分析测序的XF1基因组数 据结果(图1)表明：XF1基因组中含有与B168菌 株相似的XFsacB和XFsacA操纵子，相应的调控基 因XFsacX、XFsacY、XFsacT及双组成信号传递系统 XFdegS和XFdegU基因及相应的操纵子比较B168 和XF1菌株中上述基因编码的蛋白序列，发现除 XFsacA和XFsacB外，其他XF1中编码蔗糖代谢相 关的基因均与Bl68菌株中的基因具有完全相同的 相似性而XFsacB基因编码蛋白有13个氨基酸的 缺失(IYMLGYFSISLPA)和2个基因的突变($69一 P；K174一H)，其相似性为96；相应的XFsacA有 12个氨基酸的替换(L8一F，N24一D，V56一A， C315一Y，G358_E，K367一N，T371一A，H397一 Y，K408一T，I441一M，IA48一F，A465一S)，其相 似性为97；sacP有1个氨基酸的替换和1个氨基 酸的缺失(D93一N，A N190)，其相似性为99(表 1)用上述基因起始密码子(通常为ATG，XFsacT和 XFsacX为TTG)上游300 bp的调控序列比对B168 基因组，发现上述基因的调控序列与B168基因组序 列均有98以上的相似性这些生物信息学的分析 结果预示XF1中XFsacA、XFsacP和XFsacB的氨基 酸序列改变可能是导致该生物防治菌株具有高效蔗 糖利用效率的主要原因，为证实这一假设，我们首先 对XFsacA基因的编码区序列进行PCR克隆 XFsacT XFsacYI XFsacB lI XFlevB I l XFyveA r_ ! ! 量至至臣亘 圆 箭头表示操纵子的转录方向，显示sacT、XFsacY正调控XFsacX、XF sacA和XFsacB操纵子；degU正调控XFsacX操纵子 图1 枯草芽孢杆菌XF1中蔗糖代谢与调控相关基因的结构 及调控关系 Fig1 The organization of sucrose metabolic related to genes and their regulation in Bacillus subtilis XF1 表1枯草芽孢杆菌XF1和B168菌株蔗糖代谢相关基因的 比较分析 Tab1 Comparison of genes related to sucrose metabolism between genomes of Bacillus subtilis strains XF1 and B168 基因 基因编码区氨基酸 基因上游调控 B168菌株XF1菌株 序列相似性 序列的相似性 22 XFsacA基因编码区序列的PCR扩增 以XF1菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩 增，以8 gL琼脂糖凝胶电泳检测产物所得片段约 篙 一 第2期 贾凡等：枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证 157 14 kb(图2)，该片段与预期扩增目的片段大小相 符扩增片段经电泳分离纯化，连接入pMD18中，经 i贝0序分析确定无突变后命名为pMDsacAPCR扩增 片段序列与基因组测序的序列完全一致，即XFsacA 基因编码的蛋白相对于模式菌株B168的序列发生 了如下氨基酸替换：亮氨酸 一苯丙氨酸；天冬酰胺 一天冬氨酸；缬氨酸 一丙氨酸；半胱氨酸 一酪氨 酸；甘氨酸 一谷氨酸；赖氨酸， 一天冬氨酸；苏氨 酸 一丙氨酸；组氨酸 一酪氨酸；赖氨酸加 一苏氨 酸；异亮氨酸 一甲硫氨酸；亮氨酸 一苯丙氨酸； 丙氨酸 一丝氨酸上述突变中除缬氨酸 一丙氨 酸，苏氨酸 一丙氨酸，丙氨酸铆一丝氨酸这3个突 变对蛋白结构影响较小外，其余9个氨基酸的替代 可能对其结构与功能有较大的影响 一 bp 2 000 l 000 M：DNA Marker；14：XFsacA基因编码区PCR扩增产物；5：对照 图2 XFsacA基因编码区的PCR扩增 Fig2 PCR amplification of coding region sequence of XFsacA gene 23重组表达质粒PQE30XFsacA的构建 对pMDXFsacA质粒进行Bgl II和Hind 1I双酶 切，回收14 kb的XFsacA基因，插入到表达载体 pQE30 BamH I和Hind lII的位点上，转入JM109菌 株的感受态中通过菌液PCR检测，获得阳性菌落 将所获表达载体命名为pQE30一XFsacA(图3) COlE1 Ampicilin：氨苄青霉素抗性基因，T5：T5启动子，ColE1：质粒在大肠 埃希菌中的复制位点，XFsacA：枯草芽孢杆菌XF1中蔗糖一6一磷酸 水解酶编码区序列 图3表达载体pQE30一XFsacA图示 Fig3 Map of the expression vector pQE30-XFsacA 24 XFsacA基因的诱导表达 将重组质粒pQE30XFsacA转入原核表达宿主 BL21中得转化菌株pQE30一XFsacABL21，该菌株过夜 培养后，以体积比1：100稀释，再培养于含氨苄青霉素 的LB培养基中，待D600 至0506时，加入01 mmolL的IPTG使其终浓度1 mmolL，诱导表达，取 4 h诱导培养的菌体提取可溶性蛋白用于SDSPAGE 检测结果显示，与未转基因对照相比，在54 000附近 有增强表达的蛋白条带(图4)，与目标蛋白相对分子 质量基本一致，表明XFsacA基因获得表达 54 000 l16 000 66 200 M：蛋白相对分子质量标准；1：E coli BI21pQE30-XFsacA；2：对照 Ecoli BL21pQE30 图4 XFsacA在Ecoli BL21菌株中的表达 Fig4 The expression of XFsacA in Ecoli BI21 25含表达质粒转化子的功能验证 使用含25 gL蔗糖的M9液体培养基，分别培养 经IPTG诱导携带空载体pQE30及重组表达质粒 pQE30XFsacA的BI21菌株，定期取样监测菌液 D 和蔗糖含量的变化(图5)携带重组表达质粒 pQE30XFsacA的菌株在只添加蔗糖为唯一碳源的M9 培养基中能够正常生长，而携带空载体的菌株在其中 基本不能生长在25 h的培养中，pQE30XFsacA BL21菌液D6()0 在17 h达到最高，为0749，且蔗糖在 21 h基本消耗完，这说明该XFsacA基因在Ecoli中 得到很好的表达，并赋予了Ecoli蔗糖利用的能力 0 8 07 06 i 0 5 0 4 Q 03 02 0 1 0 +pQE3O-XFascA +pQE30-XFascA 3O 毫25 2O 15 10 氅5 q O 图5不同时期菌液 及蔗糖质量浓度的变化曲线图 Fig5 The curve of D600 n and sucrose consumption of bacteria liquid in different time 158 华南农业大学学报 第33卷 3讨论 蔗糖是自然界中储量丰富并较廉价的二糖其 作为植物的主要运输糖类，在体内有渗透调节和提 高植物抗性的作用蔗糖主要从甘蔗和甜菜中提取 获得多数微生物均能在仅含蔗糖为碳源的培养基 中生长枯草芽孢杆菌B168菌株的蔗糖代谢主要有 以sacB催化为主的胞外途径，其催化蔗糖转化为果 聚糖和葡萄糖，后者被细胞吸收并转化利用另一条 则以sacA、sacP为主的胞内代谢途径，蔗糖通过含 sacP在内的PTS系统，在消耗高能分子磷酸烯醇式 丙酮酸后，将蔗糖从胞外转运到胞内并转化为蔗糖 一6磷酸 剖蔗糖一6一磷酸在sacA编码产物的 作用下水解为葡萄糖一6一磷酸和果糖，葡萄糖一6 一磷酸直接进入糖代谢，果糖在己糖或果糖激酶的 催化下利用ATP活化为果糖一6一磷酸而进入糖代 谢sacA操纵子和sacB操纵子的表达均受抗终止转 录因子sacT和sacY的正调控和sacX的负调控 sacX和sacY组成以操纵子的表达受sacY自身和双 组成degS、degU及培养基中蔗糖的调节(图2)我们 的专利生防菌株枯草芽孢杆菌XF1在含蔗糖的培养 基中生长快速，这一独特的特征有别于同一物种不 具生物防治功能的B168菌株 通过基因组比较分析，我们发现XF1和B168菌 株中，蔗糖代谢调控相关基因的编码蛋白没有变化 各基因的调控序列均有高达98的相似性蔗糖转 运相关蛋白sacP有99相似性，而sacB和sacA差 异较大，可能是生物防治菌株XF1高效利用蔗糖的 基因基础因在胞外途径中蔗糖只有其中的葡萄糖 被利用，而果糖形成果聚糖，且许多菌株异源表达 sacB基因，在约5的高蔗糖浓度培养基中出现生长 限制和致死的表型 我们初步推论XFsacA可能是 该菌高效蔗糖利用的基因基础 Ecoli BL21菌株，含有蔗糖转运的PTS系统， 和相应的己糖激酶或果糖激酶u9 J，但缺少蔗糖一6一 磷酸或蔗糖水解酶，单一 一果糖呋喃糖苷酶(卢一 Fructofuranosidase)的准人就能赋予其蔗糖利用能 力l1，因而是很好的XFsacA基因功能验证宿主我 们克隆XFsacA基因，构建其Ecoli表达载体，转化 Ecoli BI21菌株，在IPTG的诱导下获得表达，BI21 菌株获得蔗糖利用能力，说明该基因编码蔗糖水解 酶，并能活性表达 Ecoli BI21菌株，因其安全性、清晰的遗传背 景和基因组的易操作性，是目前被工程化修饰而用 于多种高附加值产品的发酵生产的菌株 Ecoli BL2I菌株不能利用蔗糖的特性限制了其发酵产品 的生产成本XFsacA基因的克隆和功能表达为代谢 工程改造Ecoli，利用蔗糖为发酵碳源准备了基础 因植物含有较多的被运输或储藏的蔗糖，我们 推测XF1菌株高效蔗糖利用能力容易使其增加定殖 能力而提高其生物防治功能因此阐述该菌高效蔗 糖利用的基因基础不但可揭示枯草芽孢杆菌XF1的 生物防治机制，也为利用XFsacA基因来提高其他生 物防治菌的病原拮抗活性准备了条件 参考文献： 1 范成明土壤生物消毒对大白菜根肿病的防效评估及 防治机理研究D昆明：云南农业大学，2007 2吴菁，刘秀敏，张维，等枯草芽孢杆菌sacB基因的功 能验证及应用J核农学报，2008，22(5)：590-594 3TORTOSA P，LE COQ DA ribonucleic antiterminator se quence(RAT)and a distant palindrome are both involved in sucrose induction of the Bacill