试管婴儿-PPT（精）

试管动物(试管婴儿)技术进展,7.1 试管动物研究概况,7.2 获得试管动物的主要技术个环节 *,7.3 试管动物技术的相关问题,（3）张民觉先生简介,（1）超数排卵（2）精子体外获能处理；（3）卵子采集及成熟培养；（4）卵子与精子的体外受精；（5）受精卵的体外培养；（6）试管胚胎的移植。,（1）发展简史,（2）试管婴儿技术发展 *,本章目录导航,将通过体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术妊娠出生的婴儿即为“试管婴儿”。“试管婴儿”-指通过手术从母体取出卵子，加入经处理的精子之后放在“试管”中受精；再将受精卵在试管中发育约两天左右后，移至子宫内继续发育直至成为成熟的胎儿、分娩。,试管动物：系指通过精、卵体外受精、胚胎体外培养和移植获得的各种动物。也称体外受精动物。试管婴儿”成功率在世界范围内逐渐提高，平均3040左右，最高者达50%。费用:1500030000元.,体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET),7.1.1 发展简史,1878年，申克(Schenk)就对家兔和豚鼠进行体外受精试验。1944年，Rock和Menkin等从人卵巢中取出卵子，培养24h后再加入精液，经过45h培养，由133个卵子中有4个卵受精，有23细胞期的卵裂球。,-上世纪50年代前重要事件,7.1 试管婴儿发展简史,-上世纪50年代：试管动物成功！,1952年澳大利亚学者Austin博士提出精子获能理论-精子在穿入卵细胞之前，必定要经过某种形式的变化，或形态上的,或生理性改变。1954年蒂博(Thibault)首先使家兔体外受精卵分裂。1955年，Shettles从人卵巢取出卵子与精液一起培养，在培养液中加入输卵管液后，有一些受精卵发育到桑椹胚期。至此，哺乳动物和人的体外受精初步成功。,1959年，美籍华人张民觉首次将体外受精的36只兔胚胎移植到6只假孕兔的输卵管中，分娩出15只健康仔兔。张民觉通过大量实验，查阅文献，发现绝大多数哺乳类动物的受精过程，精子需要在雌性生殖道内经过某种生理变化才能与卵子受精结合。同年，Austin博士也在兔子和大老鼠的实验中发现相同现象并称之为“精子获能”。国际生理学界把他们俩的研究成果命名为“ZhangAustin原理”。,“ZhangAustin原理”：精子获能,从60年代起，Edward和Steptoe对人IVF-ET进行研究。经近20年的努力获得成功：他们将经体外受精后发育到8-cells的人胚卵，移植到母亲子宫腔内，任其生长发育，1978年7月26日诞生了第一例“试管婴儿”路易斯布朗。此后，人的IVF-ET技术在各国如雨后春笋般迅速发展起来。,上世纪60年代以后人IVF-ET研究迅猛发展，1978年首例IVF-ET成功,1980年6月澳大利亚首例试管婴儿诞生；1981年12月美国首例试管婴儿诞生；1983年10月日本首例试管婴儿诞生；1985年4月我国台湾首例试管婴儿诞生；1986年12月我国香港首例试管婴儿诞生。1988年3月10日,我国大陆第1例试管婴儿诞生于北京医科大学第三附属医院妇产科,其创始人为张丽珠教授。此后，湖南、广州、山东、上海、浙江、海南岛、重庆、四川、哈尔滨等相继开展并有成功报道。以广州中山医科大学较为突出。,1988年3月10日8时56分，中国首例试管婴儿在北京诞生。,1988年3月，北大第三医院张丽珠教授怀抱着刚刚降生的试管婴儿小萌珠,孩童 1990年3月，满两周岁的试管婴儿郑萌珠（中）和妈妈、爸爸在一起。,现已有数10种动物获得试管动物。1982年，世界上第一例“试管奶牛”诞生（Brackett等）198年，中国第一例“试管奶牛”：任吉忠-中国试管牛“产业化之父”，山东省平原县人, 1984年, 洛阳建筑材料工业专科学校经济管理系。现为深圳市澳西姆畜牧生物技术有限公司（简称澳西姆）董事长。获CCTV2006年度50强。,CCTV2006年度人物,“我有一个梦，让每个中国人，首先是孩子，每天能喝上一斤奶” -温家宝,2006.4.,IVF-ET 应用于畜牧业领域成就空前卓著,7.1.2 张民觉先生简介,张民觉：世界著名的生殖生理学家, 1908年出生于山西省岚县市,从小对生物学很感兴趣.由太原第一师范考入清华大学动物心理系.由清华大学考入了剑桥大学畜牧系学习动物生殖学。1941年冬获剑桥博士学位。,张明觉先生于1959年首先获得了试管动物兔。被誉为“试管动物之父”。,张民觉 (1908-1991)山西岚县本邑王狮乡艾蒿沟,1945年春，到美国马萨诸塞州，成为伍斯特基金会实验生物学研究所首批研究人员。一生倾心于生殖生理学科的研究，是世界上最早从事试管婴儿和避孕药品研究的科学家之一，被科学界称为“试管婴儿之父”和“避孕药之父”，先后当选为第三世界科学院院士和美国科学院的院士，三次获诺贝尔奖的提名。1991年6月5日，张民觉博士在美国麻省与世长辞，享年82岁。,7.1.3 试管婴儿技术的发展,根据各种技术出现的时间次序，可分为常规试管婴儿、单精子注射技术, 胚胎遗传病诊断技术、卵浆置换技术。这些技术无优劣之分，均有各自的适应症。（1）常规试管婴儿第一代试管婴儿常规试管婴儿即通过常规的IVF-ET获得的婴儿。其方法是从妇女体内取出卵子,于器皿内培养后,加入经处理的精子,待卵子受精后,继续培养,至分裂为28-cells时,再转移到妇女子宫内着床、发育成胎儿、分娩。,主要真对女性因素所致的不孕问题。各种原因导致的输卵管不通或功能障碍（输卵管切除、输卵管阻塞、盆腔严重粘连及输卵管结扎再通术手术失败等）。排卵障碍。 子宫内膜异位症。男方少、弱精子症。不明原因的不育。免疫性不孕。 1978年7月路易斯布朗的出生则是这一技术的结晶。,常规试管婴儿技术 解决那类生育问题？,（2）单精子注射俗称第二代试管婴儿,通过显微受精(microfertiliztion)技术获得的婴儿。显微受精的标志技术包括：-透明带下注射（subzonal injection, SUZI）和-卵细胞质内单精子显微受精（inner cell sperm injection, ICSI）。,透明带下注射 SUZI,方法：在显微作仪下，用注射针将一个或多个精子直接注入到透明带下卵周隙中使之受精妊娠。排除了由于透明带或卵质膜所形成的受精障碍。解决因男方输精管堵塞、缺如、损伤、肿瘤、绝育后复通失败、精道不通、弱精、少精等因素造成的不育者。与此相似的技术还有透明带钻孔（zone drilling）、透明带部分切口（partial zona dissection）技术。透明带机械开孔法是用酶或机械方法在透明带钻孔，然后在体外受精，以帮助精子通过透明带使之受精。,卵细胞质内单精子显微受精ICSI,该技术是1992年由比利时自由大学中心(Brussels Free University Center) Palermo等创立的辅助授精技术。方法：在显微操作仪下，将整个精子或精子的头部注射到卵母细胞质内，完成受精。特点：精子浓度、活动率对受精均无影响,可来自男性新鲜或冻融的精子，或来自附睾、睾丸穿刺取出的精子。1994年，世界上第一例“ICSI婴儿”出生。ICSI受精率高达50%至70%。之后相继在澳大利亚、美、比利时、加拿大、法国，大批以ICSI技术受精的试管婴儿诞生。我国于1996年由中山大学附属医院庄广伦等获得了中国第一例ICSI试管婴儿。,ICSI试管婴儿智商略低,“胚胎移植前遗传学诊断技术(preimplantation genetic diagnosis，PGD），是用于解决人类遗传病而发展的一项技术。PGD基于以下两种情况：一种是夫妻中某一人可能携带了遗传病基因，想确定自己的后代将来是否会受到该基因的影响；另一种情况是夫妻双方想要确定，自己是否携带了异常染色体以至于不能正常怀孕。,(3)胚胎移植前遗传学诊断技术第三代试管婴儿,PDG工艺流程,在受精卵分裂到6-8个细胞的时候，对透明带（卵壳）打孔后，取出一个细胞进行“胚胎种植前的遗传学诊断（PGD）”，选择正常的胚胎植入子宫，避免父母有遗传性疾病遗传缺陷婴儿的出生，达到优生的目的。世界上第一例经过PGD的婴儿于1990年出生。,耶鲁大学遗传学家：“定制婴儿”目前无法实现 2009-03-11 环球科学编译 褚波,日前，美国A.U.S生育研究所宣布，未来6个月内，他们将开展“婴儿定制”业务，希望拥有“完美婴儿”的夫妻可以按自己的想法挑选后代的性别、肤色、眼球颜色等。但美国生殖医学协会发言人Sean Tipton告诉科学美国人记者，按父母意愿选择婴儿的肤色和眼睛，目前在技术上很难实现，因为任何疾病都不是由单个基因决定的，头发颜色、肤色、眼球颜色也不例外。为婴儿“定制”某种特征，就必须确定哪些基因决定了某种特征。,(4)卵浆置换技术俗称“第四代试管婴儿”,置换卵质技术-虽有排卵功能，但身体条件不好，或年龄偏大，致使卵子质量不高、活力差女性。具体方法是：将卵细胞质抽出，输入另一位健康女性卵细胞质形成一个新的、优质卵细胞，再把新“造成” 的卵子与其丈夫精子结合成受精卵，植入子宫内，妊娠分娩。我国2004年2月由武汉大学人民医院专家用这一技术成功获得婴儿。是我国仅有的一例、也是最后一例由此技术产生的婴儿。,2008年，瑞士ANECOVA公司发明一种“新试管婴儿技术”。该技术的原理：是将试管婴儿的一组晶胚放入一个穿孔的胶囊型硅容器中（这种存放受精晶胚的硅胶囊约长5毫米，宽不到1毫米，壁上穿有360个孔，每个孔直径约40m）。然后植入人体子宫，使胚胎在更自然的环境中发育，数天后取出容器，再选出发育最好的晶胚重新植入受体子宫。这种新技术已在比利时进行了小规模试验。试验结果显示，在活体中生长的晶胚比试管中培育的晶胚重量更大，因此活体中生长的晶胚成活的可能性更高。,2008年03月04日 来源：科技日报,一种“新试管婴儿技术”,7.2 获得试管动物的五个主要技术个环节,体外受精-胚胎移植技术包括以下几个主要环节：第一，精子体外获能处理；第二，超数排卵（卵子的采集及成熟培养）；第三，体外受精；第四，受精卵的体外培养；第五，胚胎移植。其中诱发超排卵、体外受精和胚胎移植三项是关键技术。,7.2.1 超数排卵,早在1927年，Smith和Engle在对小鼠和大鼠做脑垂体组织在肌肉内埋植后，回收到比自然排卵多数倍的卵子，发现了超排现象。超排技术是基于雌性动物卵巢上拥有数万个卵母细胞，待出生后卵细胞数量就不再增加。不断退化，消失，自然排卵只占极少一部分而产生的。,（1）超数排卵所用的外源激素,人超排所用的外源激素：,最初用药物克罗米酚，可激发卵泡的生长。但存在卵泡成熟不同步、不易控制、卵子质量差、着床率低等缺点，后来又引进了HMG（人绝经期促性腺激素）、高纯度FSH的应用。1988年，在超排卵中使用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-) 。 1997年3月9日，第1例全部使用重组促性腺素包括重组人FSH、重组LH和HCG治疗后获得妊娠的婴儿。,动物超数排卵所用的外源激素,促卵泡素（FSH）：负责卵泡的生长发育 ；雌激素（E2）：刺激垂体，增加LH分泌；促黄体素（LH）：在和少量的FSH的协同作用下，引发排卵。孕酮（P4）：一方面抑制卵泡发育，同时刺激子宫内膜生长，为胚胎着床和维持妊娠作准备。,前列腺素(PG):不饱和脂肪酸，可引起子宫强烈收缩、溶解黄体,引发下一轮卵泡的发育和排卵。孕马血清促性腺激素(PMSG):一种糖蛋白激素，功能类似于FSH和LH的综合作用，可有效引起卵巢中多个卵泡同时发育并成熟、排卵。人绒毛膜促性腺激素（hCG）: 主要功能是促进排卵黄体转变为妊娠黄体。,掌握激素在卵泡发生过程中的调控机制。增高内源性FSH的水平，促进较多的卵泡发育。再结合使用LH，刺激卵泡的最后成熟与排放。FSH体内半衰期短，每日两次，连续使用45天。 PGSM半衰期长，在卵泡期皮下或肌肉注射一次即可。,（2）超排方法,7.2.2 体外受精技术,(1)概念从卵泡中吸取初级卵母细胞，连同卵丘细胞团一起置于特定的培养液中进行培养，使之达到可以受精的成熟阶段后，加入一定量的获能精子，使其受精成为受精卵。体外受精是以正常体内受精研究为基础，体外受精多精子受精问题普遍存在，机制不清楚。与人工精子获能和对卵母细胞的成熟培养有关。另外受精用的精子密度，精卵共培养时间，培养液的pH值和离子强度等都与多精入卵有关。,如前所述，显微受精技术就是借助显微操作仪，将精子直接注入卵母细胞质或透明带下完成受精过程，这就排除了透明带和卵质膜所形成的受精障碍，帮助精子进入卵子而完成受精。,几种主要的显微受精技术：,(1)透明带钻孔（zona drilling, ZD）：破坏透明带，使精子由破损处进入卵子并受精的方法。 (2)带下注射（Subzonal injection, SUZI） 用微注射器将精子直接注入透明带下的卵周隙内。主要解决少精或精子严重畸型例症。 (3)卵细胞浆内单精子显微受精技术（inner cell sperm injection, ICSI）：是将整个精子或精子头直接注射到卵细胞质内，使卵子受精。受精率高达50%至70%上。 (4)从睾丸和附睾取精（testical sperm extraction,TESE）：与ICSI结合(TESE-ICSI)，解决无精子排出患者生育问题。,(2)显微受精技术,7.2.3 早期胚胎的体外培养,-是 “试管动物”成功的关键。 为什么受精卵要在体外培养（或放入子宫内培养）约2天后再移植？-观察胚胎的发育状况，通过培养从中筛选更强健的胚胎，提高移植成功率；-PGC与性别鉴定。由于胚胎发育所需的条件很复杂，在体外完全模拟输卵管和子宫环境很难办到。一般培养到早期胚胎（囊胚期以前）难度不大（小鼠，1968；人，1971；家兔，1975）。向后，则难度很大。但在1982年，Y.C.Hsu和L.H.Chen将囊胚期的小鼠胚胎培养到肢芽期。,(1)受精卵的异体培养,初期，将牛体外受精卵移入结扎的同期化绵羊输卵管中，培养数日后，回收发育到桑椹胚或囊胚的胚胎，再移入作过同期化处理的受体牛的子宫中，获得了试管犊牛。但该法的回收率较低，仅为59%68.8%。随着体外培养技术的不断进步，这一技术已淘汰。,(2)从受精卵到胚泡期（移植前）的体外培养,主要解决“发育阻滞”问题。如前所述，一般是通过改善培养条件克服。,7.2.5 配子及胚胎的冷冻保存技术,20世纪70年代，由于胚胎冷冻技术的缺乏，采集的胚胎必须在数小时内移植给受体，否则只有弃掉。虽然胚胎在室温和0以下能够培养保存，但也只能最长保存24h。从研究与商业推广角度，冷冻保存胚胎具有重要价值。,(1) 配子及胚胎的冷冻保存的意义:,第一,建精子库或卵子库,赠送精子或卵子;第二,生殖保险功能,如化疗、放射治疗前保存;第三,治疗过程中先获得较多的胚胎，保存;第四,在某些情况下,如附睾取精或睾丸活检取精作卵浆内单精子注射, 保存部分精子以备下一周期使用;第五, 治疗周期发生卵巢过度刺激综合征,感染等并发症时,不移植的胚胎给予冻存。,Trounson等于1983年首次报道了冷冻保存的人胚作宫腔移植后妊娠成功的病例。目前,世界上已普遍开展了精子和胚胎的冷冻和复融技术,而卵子的冷冻和复融成功率较低,目前正在探索中。国内现在大部分IVF实验室也相继建立了精子及胚胎冻融技术。1995年2月通过移植冻融胚胎出生了首例试管婴儿。,16岁女中学生艾玛戴维斯抱着她5个月大的小妹妹尼亚姆,据英国每日快报、每日邮报、每日明星报2006.5.22报道，艾玛和尼亚姆是先后通过17年前的一组冷冻胚胎孕育诞生的，打破了一个医学史纪录-冷冻了长达16年时间孕育出生。,（2）冷冻保存方法,抗冻保护剂和冷冻溶液 在哺乳动物的胚胎冷冻过程中，冰晶的形成对胚胎的损伤是致命的。对于胚胎的冷冻和解冻，-15-50是一个致死温度区。在这个温度区，细胞内容易形成大的冰晶。加入抗冻剂能避免冰晶的形成。,常用的两类抗冻保护剂,第一类:细胞内抗冻保护剂：常用低分子量可渗物质，如甲醇（methanol ）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、甘油（GLY）、二甲基亚砜（DMSO）等。第二类:细胞外液抗冻保护剂：常用低相对分子质量不可渗物质，如半乳糖、蔗糖、海藻糖、聚蔗糖。冷冻保护液常用pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）或简单的生理盐水或TCM-199配制。,冷冻与解冻方法,第一，常规冷冻法。也称快速冷冻法，是目前实践中常用的方法。其步骤如下：-将采集的胚胎在含20%小牛血清的PBS中洗涤2次；-在室温下加入含1.4mol/L的甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡20min；-将胚胎和冷冻液装入0.25ml的细管中，封口，并在细管外作好标记，如日期、胚胎数、供体号等；-将细管放入冷冻仪中，在0平衡10min，以1/min的速度降至6-7，并在此温度下诱发结晶，并平衡10min，然后在0.3/min降温至于35-38，投入氮保存。-从液氮中取出细管，立即投入到37水浴中，轻轻摆动，1min后取出即完成解冻；-用0.2-0.5mol/L蔗糖PBS液分两步或一步法脱除冷冻保护剂，使胚胎复水、移植。,胚胎冷冻法有多种，主要介绍几种快速冷冻法:,第二，一步冷冻法。在冷冻前利用高浓度的抗冻剂使胚胎脱水，从而减少冷冻过程中细胞内冰晶的形成，胚胎在室温下脱水后，不需要特殊的降温程序，勇夺很短时间内完成冷冻过程。实用价值高。其具体步骤与常规冷冻法前三步相同，第四步将装胚胎的细管在液氮颈部预冷5min后投入液氮保存。解冻时，取出细管后，先在空气中平衡10s，再置于37水浴解冻；之后，去除冷冻保护剂量。,第三，玻璃化法。是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法。玻璃化冷冻时，由于所用溶液在低温下变粘稠，不发生结晶而形成一种特殊的固化的“玻璃化” 状态，大大减少了冷冻伤害。为了在一定冷冻速度下形成玻璃化，需要使用高浓度的可渗低温保护剂。将在0以上的抗冻保护液中平衡后的胚胎直接投入液氮中保存，简化了胚胎冷冻操作程序，大大缩短了冷冻时间，由传统的3h减少到40min，并且不需要复杂昂贵的冷冻仪器，实践中易于推广应用。,（1）移植前的遗传学诊断（PGD）PGD是从IVF后610个细胞阶段的胚胎活检12个细胞，应用分子学技术或荧光原位杂交方法测定DNA片段或特定染色体,将诊断无遗传病的胚胎移植入子宫，从而保证妊娠胚胎的正常,防止遗传病患儿的出生（俗称的第三代试管婴儿技术）。,7.2.5 人胚胎移植,（2）培养胚胎移植的时期,理论上，胚胎在受精后的第16天均可移植。但是，为了选择质量更好的胚胎，一般于取卵后48h胚胎发育成28个细胞阶段或在取卵后72h胚胎发育至816个细胞时植入子宫。后者较符合自然受精胚胎进入子宫的时间，且在传统体外培养条件下，只有最健康的胚胎才能活到3天，故移植成功率高。试管婴儿移植到子宫的最晚时期：在体外培养到胚泡期/囊胚期（即胚胎分化出内细胞团和滋养层时）。,(2)减胎”手术研究发现，单胚移植妊娠成功率为10.7，2个胚胎移植的成功率为32，4个胚胎移植的成功率为37.8，而移植5个胚胎的成功率下降，仅为13。目前认为，移植24个胚胎较为合适。 常产生双胎、多胎。 “减胎”具体办法是，怀孕周后，在超的引导下，根据胚胎的位置和质量取出一个或两个胚胎，以确保剩余者健康发育。,尝试用人造子宫孕育生命(图), 2005年10月25日11:24 科技新时代杂志,附:胚胎的体外培养技术研究：人造子宫技术,人造子宫研究,刘鸿清，美国康奈尔大学生殖医学和不育症研究中心“生殖与内分泌实验室”负责人。 “人造子宫”是她进行试管授精技术研究的副产品，当时的目的是为了帮助胚胎无法在子宫中着床和生长的不育妇女。自2001年起，刘鸿清的实验室便开始了以取自人体子宫内膜的细胞为基础，培养单片人体组织。最初的细胞是由不育症患者捐赠的子宫内膜细胞。,刘鸿清的人造子宫的结构,-先筑造出一个支架-也就是用可以生物分解的胶原质和软骨素制成的子宫形状的培养床；-然后在上面“播种”子宫内膜细胞。-过了一段时间之后，用作支架的物质分解掉，剩下了覆盖在上面的子宫内膜组织。-接下来，她在人造人类子宫上面放置上试管受精剩余的人胚胎。这些受精卵成功着床并开始生长，生长10天之后，刘鸿清便不得不中止了试验。因为目前美国法律的相关规定，在实验室中培育人类胚胎的时限是两个星期。,2002年，她和同事们开始制造人工老鼠子宫并在里面培育老鼠的胚胎。最初在塑料培养皿中培养出的组织只是象蜘蛛网那样薄薄的一层细胞。希望胚胎能够在这种组织上着床，以了解更多有关胚胎着床的机理，没能成功。不断生长的胚胎冲破人造组织，接触到下面的培养皿，然后就像树木的根被石头阻断了一样死去,后