酶PPT演示课件

.,1,报 告 人 ：秦 萱 2017101010,酶工程在检测领域中的应用,.,2,应 用 背 景,1,2,酶 传 感 器 技 术,2,目录,3,酶 抑 制 技 术,4,酶 免 疫 技 术,.,3,3,应用背景,.,4,4,生物检测：利用生物的组分、个体、种群或群落对环境污染或环境变化所产生的反应, 从生物学的角度,为环境质量的监测和评价提供依据。 具体来说，即当空气，水体,土壤等环境要素受到污染后，生物在吸收营养的同时，也吸收了污染物，并在体内迁移，积累，从而遭受污染,受到污染的生物，在生态，生理和生化指标，污染物在体内的行为等方面会发生变化，出现不同的症状或反应，利用这些变化来反应和度量环境污染程度的方法。,.,5,如水中DDT农药:水中浓度为0.000003mgL浮游生物（富集7.3万倍） 小鱼 (富集14.3万倍) 大鱼 （富集858万倍） 人食用这些水中生物后富集1000万倍。,以上过程，只有通过生物监测手段，通过食物链放大了的各营养级进行分析，才能对水体进行全面评价,.,6,6,.,7,7,现代生物技术的基本简介现代生物技术其主要包含有分子生物学、微生物学、系统生物学以及免疫学等多种理论，而且与化学、计算机以及微电子等多种学科相互结合，综合性较强，因而具有十分广泛的应用。现代生物技术的特点操作过程简单快捷有效地减少资源浪费和环境污染具有较高的纯度和较高的安全性可实现连续化操作,.,8,8,4 研究创新点,检测中常用的几种现代生物技术生物芯片技术生物发光检测技术PCR技术生物传感器技术金标免疫速测技术,有较强的特异性、灵敏性和准确性，操作简单快速,.,9,9,4 研究创新点,检测中常用的几种现代生物技术生物芯片技术生物发光检测技术PCR技术生物传感器技术金标免疫速测技术,有较强的特异性、灵敏性和准确性，操作简单快速,1.酶抑制技术2.酶免疫技术,酶传感器技术,.,10,10,酶传感器技术,.,11,1.生物传感器原理及分类,生物传感器的结构一般是在基础传感器(如电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质上时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的O2、H2、NH4+、CO2等或光声等信号，并通过信号转换元件转换为电信号。,.,12,根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感材料可分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、基因传感器、细胞及细胞器传感器。,.,13,由于酶是蛋白质组成的生物催化剂，能催化许多生物化学反应。酶的催化效率极高，而且具有高度专一性，即能对待测生物量（底物）进行选择性催化，并且有化学放大作用。因此利用酶的特性可以制造出高灵敏度、选择性好的传感器。,2.酶传感器,.,14,酶传感器的发展,根据酶与电极之间的电子传递机理，酶传感器发展经历了三代。 第一代酶传感器是以氧为介体的电催化。 Barsan等研究在钴、铁氰化铜及聚乙烯3种媒介上固定葡萄糖氧化酶，设计了基于电化学酶生物传感器的碳膜流动室，用以监测葡萄汁发酵过程中的葡萄糖。上述研究均采用氧作为葡萄糖氧化酶的电子传递剂，也就是传统意义上的第一类葡萄糖传感器。这种酶传感器通过检测氧消耗量或H2O2浓度变化来测定底物，受溶解氧、pH值、温度影响很大。,14,.,15,第二代酶传感器是以诸如二茂铁、铁氰化钾等物质作为媒介体的电催化 该种酶传感器增加了化学修饰层，扩大了基体电极可测化学物质的范围，提高了测定灵敏度。电子媒介体促进电子传递过程，减小了溶解氧的干扰。但加入的媒介体易污染电极，影响电极性能。常用的媒介体主要有二茂铁及其衍生物、铁氰酸盐、醌类、有机导电盐、有机染料和有机介体等。 第三代酶传感器是酶在电极上的直接电催化。该种酶传感器无需加入其他试剂，而利用酶与电极间的直接电子转移，减少了操作步骤，是目前酶传感的重要发展方向之一。但酶通常具有较大分子量，其电活性中心深埋在分子的内部，且在电极表面吸附后易发生变形，所以酶与电极间难以直接进行电子转移。到目前为止，仅有少数相对分子量较小的酶如过氧化物酶、氧化酶、氢化酶和脱氢酶、超氧化物歧化酶等能够在电极上直接进行有效的电子转移。,15,.,16,生物敏感膜,利用生物体内具有特殊功能的酶制成的膜，在与被测物质接触时伴有物理、化学变化的生化反应可以进行分子识别。生物敏感膜是酶传感器的关键元件，它直接决定着传感器的功能与质量。,信号转换器,信号转换器是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物理的变化转换成可用信号的装置。生物传感器的信号转换器已有许多种，其中到目前为止用得最多的且比较成熟的是电化学电极。,酶传感器主要元件,.,17,生物活性材料固定化技术,使用酶作为生物敏感膜，必须研究如何将其固定在载体（或称基质）上，这种结合技术称为固定化技术。,生物敏感膜,常用载体：丙烯酰胺聚合物、甲基丙烯系聚合物等合成高分子胶原、右旋糖酐、纤维素、淀粉等天然高分子陶瓷、不锈钢、玻璃等无机物,固定化生物敏感膜应该具有的特点：对被测物质选择性好、专一性好性能稳定可以反复使用，长期保持其生理活性使用方便,常用的固定化方法：夹心法、吸附法、包埋法、共价连接法、交联法,.,18,1、夹心法是将生物活性材料封闭在双层滤膜之间。依生物材料的不同而选择各种孔径的滤膜。 （用于酶膜制作时稳定性较差）,滤膜的选择,.,19,2、吸附法是用非水溶性载体物理吸附或离子结合，使蛋白质分子固定化的方法。载体种类繁多，如活性炭、高岭土、羟基石灰石、铝粉、硅胶、玻璃、胶原、磷酸钙凝胶、纤维素和离子交换器等。吸附法主要用于制备酶和免疫膜，吸附过程一般不需要化学试剂，对蛋白质分子活性影响较小，使蛋白质分子容易脱落，特别在环境条件改变时。故常常与其它固定化方法结合使用，如吸附交联法。,.,20,3、包埋法将酶分子包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构基质中。包埋法的特点是一般不产生化学修饰，对生物分子活性影响较小，膜的孔径和几何形状可任意控制，被包埋物质不易渗漏，底物分子可以在膜中任意扩散，缺点是分子量大的底物在凝胶网格内扩散较困难，因此，不适合大分子底物的测定。,.,21,4、共价结合法是生物活性分子通过共价键与不溶性载体结合而固定的方法。蛋白质分子中能与载体形成共价键的基团有游离氨基、羧基、巯基、酚基和羟基等。有机载体如纤维素及其衍生物、葡聚糖、琼脂粉、骨胶原等，无机载体使用较少，主要有多孔玻璃、石墨等。根据酶与载体之间的结合形式可以有重氮法、肽键法、烷化法等，以重氮法较为多用。共价结合法多用于酶膜制作。,.,22,5、交联法此法借助双功能试剂使蛋白质结合到惰性载体或蛋白质分子彼此交联呈网状结构。,交联法广泛用于酶膜制备，操作简单，结合牢固，在酶源困难时常常需要加入数倍酶的惰性蛋白质作为基质。 本法存在的问题是在进行固定化时需要严格控制pH，一般在蛋白质的等电点附近操作。在交联反应中，酶分子不可避免地会部分失活。,.,23,将热变化转换成电信号,固定化的酶与相应的被测物作用时常伴有热的变化。大多数酶反应的热焓变化量在25-100kJ/mol的范围。其工作原理是把反应的热效应借热敏电阻转换为阻值的变化,后者通过有放大器的电桥输入到记录仪中。,将光信号转变为电信号,例如，过氧化氢酶能催化过氧化氢/鲁米诺体系发光，因此如设法将过氧化氢酶膜附着在光纤或光敏二极管的前端，再和光电流测定装置相连,即可测定过氧化氢含量。还有很多细菌能与特定底物发生反应，产生荧光，也可以用这种方法测定底物浓度。,将化学变化转变成电信号,酶催化特定底物发生反应，从而使特定生成物的量有所增减。能把这类物质的量的改变转换为电信号的装置和固定化酶耦合，即组成酶传感器。常用转换装置有氧电极、过氧化氢电极。,信号转换器,.,24,酶传感器的特点,操作简单，需用样品少，能在短时间内完成测定。一般不需进行样品的预处理，它利用本身具备的优异选择性把样品中被测组分的分离和检测统一为一体，测定时一般不需另加其他试剂,使测定过程简便迅速，容易实现自动分析。对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可反复使用。传感器连同测定仪的成本远低于大型的分析仪，因而便于推广普及。主要缺点是寿命较短。,.,25,25,酶传感器的分类,.,26,26,例1：酚类的测定,水体中的酚类化合物污染常见于炼油、焦化、造纸、化工、木材防腐等行业废水中,是水系“五毒”之一。测定酚类可采用高灵敏度的酶电极安培传感器。酶电极表面的酶分子被氧化或被过氧化氢氧化，接着被酚类化合物重新还原，酚类化合物则被转化为酚自由基，这些产物通常具有电化学活性，能在相对于饱和甘汞电极0V以下的电位还原，还原的电流与溶液中酚类化合物的浓度成正比。,酶传感器的应用,.,27,例2：碘电极测量葡萄糖浓度,.,28,由于单酶传感器只能测定数目有限的环境污染物，可以在一个生物传感器上偶联几种酶促反应来增加可测分析物的数目。多酶传感器的例子之一就是糖原磷酸化酶与一个碱性磷酸酶变旋酶葡萄糖氧化酶相结合以测定无机磷酸盐。结合多种酶之后，分析物的数目就可以增加，如共固定酪氨酸酶和漆酶之后就能检测多种酚类化合物。,29,29,酶抑制技术,.,30,原理： 生物酶抑制技术是利用环境污染物,如农药、重金属等在体外对特定酶具有抑制作用的原理。加入该酶催化的底物 (显色剂),显色剂是否显色以及显色程度反应了酶是否受抑制以及抑制的程度,以此来判断检测环境污染物是否存在以及含量的多少。,30,.,31,31,酶抑制法属于生物化学测定法类型，是相对成熟的一种对有机磷与氨基甲酸酯类农药进行残留检测的技术，目前在我国农药残留速测中使用最为广泛。有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶（AchE)的活性破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死，利用这一毒理学原理，将氨基甲酸酯与样品反应，根据氨基甲酸酯酶活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有有机磷与氨基甲酸酯类农药。利用酶抑制检测蔬菜水果等农产品目前有农药残留快速测定仪(速测仪)和农药残留快速测定卡(速测)两种检测方式。,2. 应用：1）在农药残留检测方面，酶抑制技术主要用于有机磷与氨基甲酸酯农药的检测,.,32,农药残留快速测定卡,32,胆碱酯酶可催化靛酚乙酸酯(红色)水解为乙酸与靛酚(蓝色)。有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否含有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药。,与空白对照卡相比较。白色药片几乎不变色为强阳性结果，说明农药残留量较高。显浅蓝色为弱阳性结果，说明农药残留量相对较低。白色药片变为天蓝色为阴性结果。,.,33,农药残留快速测定仪(速测仪),33,有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关关系。 酶催化神经传导代谢产物(乙酰胆碱)水解水解产物与显色剂反应，产生黄色物质用农药残留速测仪测定吸光度随时间的变化值计算出抑制率 判断出样品中是否含有有机磷或氨基甲酸酯类农药,样品的抑制率40%-50%为可疑农药残留超标样50%为超标样40%的样品需要重复检测两次以上50%的超标样应用气象色谱仪进行精确检测确认,.,34,34,2. 应用： 2）重金属检测,基本原理： 重金属离子与形成酶活性中心的琉基或甲琉基结合后，改变了酶活性中心的结构与性质，引起酶活力下降，从而使底物一酶系统中的显色剂颜色、PH电导率和吸光度等发生变化。,.,35,脲酶广泛存在于自然界中，主要来源于豆类植物，如刀豆脲酶、黄豆脲酶等。脲酶可催化尿素水解，产生CO2和NH3，反应速度比无脲酶催化快104倍。 酶催化尿素水解的反应方程式为：,35,2）重金属检测：脲酶应用实例,环境样品中存在重金属离子时，脲酶活性受到抑制，作为其分解产物的氨也相应减少。环境样品中的重金属离子对脲酶活性抑制率的高低，可以反映重金属离子量的多少，根据指示剂颜色或反应液pH值的变化，就可以对环境样品中的重金属离子进行定性或半定量分析。,.,36,36,.,37,37,酶免疫测定技术,.,38,原理： 以环境污染物作为抗原,免疫动物获得特异性抗体,该抗体与抗原在动物体外也可以进行特异性的反应。引入一种酶作为示踪物,常用过氧化物酶等以揭示微量抗原与抗体的免疫学反应进行情况。 分类： 根据其特点和步骤可以分为酶联免疫吸附测定法（ELISA）和酶放大免疫测试法（EMIT）,38,.,39,酶放大免疫测试法(EMIT),EMIT是一种经典的均质酶免疫测试技术。基本原理是用特定的酶标记待测物质，然后将抗体、酶标记物质、待测物质同时加入反应试管中进行竞争反应。酶标记的待测物质与抗体结合后，酶被抑制而失去活性。样本中待测物质越多，则游离的未被抑制的酶也越多，根据吸附反应后酶活性的改变可以测定出物质的含量。该法的缺点就是每一种待测物质都必须进行酶标记，限制了该法的推广应用。,39,.,40,40,将具高度特异性的抗原抗体反应结合酶对底物的高度催化效应,对受检样品中的酶标免疫反应的实验结果采用现代光学分析仪器进行光度测定。 在ELISA检测过程中,酶催化具有高度的放大作用,许多种酶分子每分钟能催化生成105分子以上的产物,使测定更为灵敏、准确,检测极限达0.01一0.1mg/kg.,酶联免疫吸附测定技术(ELISA),直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加入酶标记物质和待测物质，酶标记物质和待测物质之间与抗体的竞争而发生结合反应。由于待测物质多，则反应后被吸附到反应板上的酶标记物质少，即吸附到酶反应板上的酶标记物质的量与待测液中物质的含量成反比。加入酶底物显色后，进行比色，可以测定待测物质含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记抗体(一抗)，而是标记第二抗体，在竞争反应结束后，加入酶标二抗，发生一抗与酶标二抗的结