MAF1基因的时空差异表达研究毕业论文

1目 录 摘 要 第 3 页1. 前 言 第 4 页2. 材料与方法 第 6 页3. 结 果 第 11 页4. 讨 论 第 15 页参考文献 第 17 页致 谢 第 19 页2MAF-1 基因的时空差异表达研究学生：伍凤 导师：付萍讲师【摘要】 家蝇体内丰富的抗细菌肽、抗真菌肽等是其免疫防御机制中不可或缺的部分。家蝇抗真菌肽-1（ Musca domestica antifungal peptide-1,MAF-1）是从家蝇幼虫血淋巴中所提取的，并采用固相萃取结合反相高效液相色谱(RP-HPLC)的方法分离到的一种新发现的抗真菌肽。为了进一步研究该基因在家蝇幼虫各个部位以及各个龄期的表达是否存在着差异，我们采用了Real Time-PCR技术研究了该基因在不同的发育时期(卵、1 龄幼虫、2 龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)和幼虫不同的部位(脂肪体、肠道、体壁、唾液腺)的表达量，结果显示 MAF-1基因在所选的不同时期个部位都有所表达。其中幼虫期间的表达量比较高，而不同部位中，唾液腺、脂肪体表达量较高。而且，在整个家蝇的生长发育阶段，MAF-1 基因的表达量是呈现下降趋势的。进一步肯定了抗菌肽在家蝇的免疫防御体系和生长发育期间，尤其是幼虫期间发挥着重要作用。为其下一步更深入探索其免疫机制的研究，丰富对昆虫天然免疫的认识及新一代抗真菌生物制剂的研制奠定了理论基础。【关键词】家蝇 抗菌肽 MAF-1 Real Time-PCR 时空表达Abstract Inside the house antimycobacterial peptides, rich of antifungal peptide immune defenses such is the indispensable part. Domestica antifungal Musca domestica peptide - 1 (Musca domestica antifungal peptide-1, MAF - 1) domestica larva in from blood lymph extracting, and by solid-phase extraction combined with reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC) method of RP - a new separation to discovery of antifungal peptides. In order to further study the gene domestica larva each place and all periods of expression whether there is any difference between, we use the Real Time-PCR technology research the genes in the different developmental stages (eggs, larvae, 2 age 1 year, 3rd instar larvae grubs and pupa, adult and male and female) and different parts (fat body, the intestinal tract, the body wall, salivary gland) expression and Results showed that in re-ligion MAF - 1 genes in different periods of a site have expressed. The expression of larvae quantity 3taller during, and different parts of salivary glands, fat body, express high. And, in the whole growth stage, the domestica MAF - 1 gene expression of the quantity is the downward trend. Further affirmed domestica antibacterial peptides in the immune defense system and growth plays an important role. For its next more in-depth study of exploring the immune mechanism of insects, rich natural immune awareness and a new generation of antifungal biological preparation research laid a theoretical foundation. Keywards：Musca domestica antifungal peptide AF-1 RT-PCR Temporal and spatial expression前言 昆虫是世界上最大的生物种群。为适应各种不同的生态环境，它们形成了独特的免疫系统，即缺乏 B、T 淋巴系统，不能产生免疫球蛋白和补体。昆虫特别是蝇类能够有效的抵御病原微生物的入侵, 而本身不受感染. 天然免疫是它们对抗各种微生物入侵的一线防御系统, 这和哺乳动物有一定的相似性, 这说明了它们之间有一定的进化关系 1,2.近年来研究发现昆虫体内许多活性物质，具有高等动物免疫分子类似的功能，如抗菌肽便是典型的代表。白 1974 年 Boman 等首次从惜古比天蚕蛹诱导分离纯化出第一种天然抗菌肽天蚕素(cecropin)以来，昆虫抗菌肽逐渐成为生命科学领域研究的热点。目前研究表明, 以 cecropins, attacins, drosomicins 等抗菌肽产物为基础的天然免疫是昆虫抵御病原体和寄生虫的重要防线.近年来, 人们也开始在蝇类中探索免疫系统的起源和进化, 为研究昆虫天然免疫和人类的天然免疫的相关性提供证据.。家蝇(Musca domestica)属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科，是我国大部分地区最常见、数量最多的一种媒介昆虫。在自然界中，家蝇是传播疾病的重要媒介害虫，它能给人、畜传染多种疾病，但自身并不染病，即使在高密4度人工饲养的条件下也不会发生大规模传染病而死亡。家蝇对恶劣环境具有极强的适应能力和独特的免疫防御机制(王继恒等，2000)，预示家蝇体内含有丰富的抗菌物质。目前，家蝇的高效抗病能力的研究受到了广泛的关注(崔晓江，刘枝俏，1995；Okada，Natori，1984；孙刚等，1995；赖凡等，1999)。家蝇体内外具有多种抗菌物质是其在杂菌横生的环境中得以生存的重要物质基础，对家蝇抗菌活性物质的进一步研究具有十分重要的理论意义和应用价值。有关学者已在地中海实蝇 Ceratitiscapitata、 4果蝇 Drosophilam elanogaster5和厩赦蝇 Stonxoxyspo regrinn6中分离到具有不同生物活性的抗菌肤。在棕尾别麻蝇 Sarcophagaperegrina 和伏蝇 Phormia terranova。体内分离到了 sarcotoxinI 7.8.9和 diptericin 等 具有抗菌活性的蛋白。而在家蝇血淋巴中既分离到了分子量较小的生物活性肤/蛋白，又分离到分子量较大的凝集素溶菌酶等多种抗菌肤。这些抗菌肤抗细菌、真菌、寄生虫，更引人注目的是它们还能杀伤多种肿瘤癌细胞和病毒，而对正常的体细胞无毒副作用。抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌等。还抗植物细菌性病害如水稻白叶枯病菌，大白菜软腐病菌和引起人类疾病的痢疾杆菌、肺炎杆菌。对一些真菌如白念珠菌和白僵菌也有很好的生物活性，也对令人畏惧的肿瘤癌细胞有活性。邱晓燕等分离到分子量为 4 kDa 和 9.6 kDa 的抗菌肤，较低浓度下能有效抑制人胃癌细胞 MGC80-3 和 BGC-823、人乳腺癌细胞 MCF-7以及人肺癌细胞 SPC-A-1 的体外增殖。 11还抑制病毒侵染和繁殖，陈艳等用蝇蛆组织匀浆液处理流感病毒表现出非常好的防效。 12这些抗菌肤活性浓度在 ug/mL 级，其抑菌效果与传统抗生素相当甚至超过之。有报道表明苍蝇抗菌肤的抗菌活性超过了青霉素 13，与目前广泛使用的抗生素及农用杀菌剂不产生交互抗性，不诱导病原菌产生抗性突变，因此有望开发成为新一代优秀抗癌、抗病毒或抗病菌药物。M 家蝇抗真菌肽-1（Musca domestica antifungal peptide-1,MAF-1）是从家蝇幼虫血淋巴中所提取的，并采用固相萃取结合反相高效液相色谱(RP-5HPLC)的方法分离到的一种新发现的酸性抗真菌肽。在家蝇防御体系中发挥着重要作用。那么，究竟此抗真菌肽是如何发挥免疫作用，乃至此抗真菌肽在整个免疫系统中是如何表达。换言之，是否此抗真菌肽在家蝇从卵到成虫的各个龄期都有所表达。是否存在雌雄的表达差异。是否于幼虫的各个部位都有所表达，即是否存在着组织分布的特异性。这一系列的问题，都有待着我们进行深入的研究。于是，本文采用了 Real Time-PCR 技术对该基因在不同的发育时期(卵、1 龄幼虫、2 龄幼虫、3 龄幼虫、蛹、成虫以及雌雄)和幼虫不同的部位(脂肪体、肠道、体壁、唾液腺)的表达情况进行研究分析。材料与方法1.材料1.1 实验蝇株来源实验室虫室常规养殖。温度（25）相对湿度（80%）光照（12H/D）1.2 MAF-1 序列来源前期从家蝇幼虫分离到的 MAF-1 蛋白的 N 端序列，通过 RACE 技术获得了 MAF-1 的部分 cDNA 序列，已登录到 GenBank，获得登录号，登录号HM178948。1.3 主要生物信息学分析网站，软件和引物设计软件家生物技术信息中心网站（National center for biotechnology information,NCBI） ；瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统网站（Expert protein analysis system,EXPASY） ； DNAMAN 软件；PRIMER PREMIER 5.0; Oligo 6.061.4 主要试剂、试剂盒逆转录试剂盒（ABI 公司） ；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser；SYBR Premix Ex TaqTM ；限制性内切酶（以上均为大连宝生物公司） ；Trizol 试剂；质粒提取试剂盒；无 RNasc 的 DNase ；Taq DNA 聚合酶；PCR 引物；DNA Marker；1.5 主要溶液01DEPC 水：lmlDEPC 加入 1L 三蒸水中，振荡过夜后 15psi 高压灭菌。Hepes saline 0.15mol/l NaCl,10mmol/l hepes,调节 PH=7.0 。20umol/l 腺苷 HS 液 1.336mg 腺苷溶于 250ul HS5xTBE 电泳缓冲液 tiis 碱 54g、硼酸 27.5g、0.5mol/l EDTA(ph8.0)加三蒸水至 900ml,充分溶解，定容 1000ml.使用时，稀释 10 倍至 0.5 X TBE1.6 主要实验仪器ABI 7300 Real-TimePCR system PCR 扩增仪（德国 Eppengorf 公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司） ；显微解剖镜（尼康） ；稳压稳流电泳仪（美国 GE 公司） ；紫外分光光度计（美国 GE 公司） ；5415 型冷冻离心机（德国 Eppengorf 公司） ；PB203-E 型电子精密天平（上海梅特勒托利多仪器公司） ；微量加量器（10ul 20ul 100ul 1000ul 德国 Eppengorf 公司）2. 方法2.1 总 RNA 的提取1）于显微镜下，解剖家蝇三龄幼虫，提取其体壁、肠道、脂肪体、唾液腺，另取家蝇不同的发育时期(卵、1 龄幼虫、2 龄幼虫、3 龄幼虫、蛹、7成虫以及雌雄)组织约 30ug，分装于 EP 管中。采用 TRIZOL 试剂提取总 RNA。2)提取物浸于 1000ul Trizol 中；震荡混匀，避光，反复冻融 3 次；3)加 400ul Trizol,室温放置 5 分钟，加入 100ul 氯仿，漩涡震摇15s，静置 5min，4，12000rpm 离心 15min。4)仔细吸取上层水相，移至另一新的离心管仲，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。5)室温放置 10min，然后于 4，12000rpm 离心 20min 沉淀 RNA，弃去上清。6)加入 lml 75乙醇，轻轻震摇，充分洗涤 RNA 沉淀，4，12000rpm 离心 7500g，5 分钟，弃上清，除去乙醇。7)室温干燥 RNA，重溶 RNA 于 100ul RNase-free 水中，65水浴10min 以助溶。2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定总 RNA 的完整性对消化后的 RNA 样品用琼脂糖凝胶进行电泳，检测 RNA 分子的完整性。l)用 0.5 X TBE 100ml 溶解 1g 琼脂糖。配置 1%琼脂糖凝胶，微波炉加热至完全融化后，室温冷却至 60 度左右，加入 5ul EB，混匀，倒入插好梳齿的制胶槽中冷却制胶。2)将制好的胶块浸没于装有 0.5 X TBE 电泳缓冲液的电泳槽中。3)取 1ul RNA 样品，加入 1ul 10 X loading buffer 混匀后上样。4)100V 电压下电泳。5)电泳结束后，紫外灯下观察，鉴定 RNA 分子的完整性。2.3 总 RNA 定量用 98ul Milli-Q 水将 2ul RNA 原液稀释 50 倍后，利用紫外分光光度计分别测定其在 260nm 和 280nm 波长处的吸光度（ OD260 和 OD 8280）通过下述公式计算 RNA 的浓度。同时，计算 OD260 和 OD280 的比值（OD260/OD280） ，当两者的比值在 1.82.2 时，说明提取的 RNA 纯度高，无蛋白质和 DNA 的残余。2.4 总 RNA 去除 DNA 基因组1)在微量离心管中分别加入下列成分2)42反应 2 分钟2.5 逆转录合成 cDNA1) 向 PCR 小管中分别加入下列成分试剂 使用量5 X PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4ul PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1ulRT Primer Mix 1ul2.4 的反应液 10ulRNase Free dH20 Up to 20ul2) 37 15 min3) 85 5 sec4) -20 保存。2.6 设计引物利用 Primer premier 5.0 和 Oligo 6.0 软件设计引物。引物由TAKARA 公司合成。MAF-1 Forward: 5-TGCTGTCTTCAGTGCCATCC-3试剂 使用量5 X gDNA Raser Buffer 2ulgDNA Eraser 1ulTotal RNA 1ugRNase Free DH2O Up to 10ul9Reverse: 5-CCCTCAATCCAGACCTTCAT-3 GAPDH Forward: 5-CATCATCTCCGCTCCATC-3 Reverse: 5-AAGCCATACCAGTGAGTTTACC-32.7 实时荧光定