MCP对几种果实衰老的效应及调控机制研究【PPT课件】

我们毕业啦其实是答辩的标题地方,1-MCP对几种果实衰老的机制以及调控指标,乙烯与果实的衰老,1-MCP对影响乙烯作用的机制,材料与处理,测定方法,CONTANTS,结果与分析,总结,1,1 果实的衰老,果实衰老：一个复杂的生理生化和结构变化的过程，包括果实香气、风味、质地等不可逆的变化,跃变型果实成熟时适量的外源或基础乙烯(系统I乙烯)能够启动大量自催化的内源乙烯(系统II乙烯)产量的上升，内源乙烯产量的突然升高，往往被认为是果实色泽、风味和香味物质等生理生化指标开始发生不可逆变化的标志，因而乙烯成为该类果实成熟的启动和调节的关键因子。例如增加细胞膜透性、刺激呼吸升高，引起果实内有机物质强烈转化和加速果实软化,非跃变型果实成熟的启动与调节虽然并不依赖于乙烯的作用，但在果实成熟的某一阶段使用外源乙烯也会起到一定的生理作用，如外源乙烯可以促进该类果实的呼吸，不过这种促进会在去除外源乙烯后消除,此外乙烯还参与果实中叶绿素的降解和类胡萝素的合成,跃变型果实,非跃变型果实,2 乙烯与果实的软化,果实软化是果实成熟衰老过程中构成细胞壁的果胶质和纤维素、半纤维素在细胞壁修整酶作用下不断降解的结果,木葡聚糖的分解,果胶的降解,细胞壁的降解,许多细胞壁水解酶可以协同作用于该阶段，包括纤维素酶，(XET)和膨胀素。其中膨胀素尤为重要，它是植物细胞壁松弛的蛋白质，该酶的基因在果实成熟过程中受低浓度乙烯的控制，可能是该过程的调节因子。,主要是多聚半乳糖醛酸酶(PG)。PG调节的果胶降解对果实的早期软化影响不大，但在过熟组织的软化过程中作用是十分明显的（Orr and Brady等在桃子）,转ACS反义基因(Hamilton）和ACC脱氨酶基因（Klee ）的番茄果实在成熟时都表现出极低的乙烯生成量，同时其果实都不能正常软化，表明乙烯作为调控果实成熟的主要激素，在调节果实软化酶，控制果实软化过程中起了重要的作用。另外乙烯启动并参与了梨果实的软化进程，青椒中一种成熟相关的纤维素酶也被发现受到乙烯的诱导,活性氧可能通过刺激ACO活性而参与了乙烯的合成，Na2S203作为外源活性氧的试验表明，超氧阴离子对香蕉果实成熟过程中ACO活性表现出双重性，即在初期的促进和后期的抑制,3 乙烯的合成与控制,ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)为该合成途径中的关键酶，二者与ACC的积累共同调节果实中乙烯的产量,ACS含量极少，一般为总蛋白量的0.0001，且极不稳定,乙烯的合成与控制,ACS和ACO在乙烯生物合成途径中的关键性作用对ACS和ACO活性进行抑制的主要方法有低温、气调，热、冷激处理、激素互作、抑制剂等。其中加抑制剂是最方便的方法，而效果明显的抑制剂有AVG和AOA以及水杨酸(SA)等。,AVG和AOA能够抑制ACS的活性，阻止SAM向ACC的转化,桃果实在采前8天喷施AVG可以延迟果实采收时间，增加果实中可溶性固形物含量，明显延缓果实采后的软化进程，乙烯的释放也被抑制了64，而且它还能抑制果实虎皮病的发生,2,1 对乙烯受体的抑制,乙烯要发生作用，需要首先与受体中乙烯的结合位点相结合。1-MCP分子呈平面结构，具有比乙烯更高的双键张力和化合能(Sisler and Serek，；Sisler and Serek，)，可以更好的与乙烯竞争结合位点。,人们推测，结合位点含一未知金属，1-MCP与这一未知金属的结合是不可逆的，或者至少保留很长一段时间(Sisleretal)。在此基础上，Sisler和Serek进一步推测1-MCP与乙烯受体中未知金属结合以后，改变了乙烯受体中电子云的密度和乙烯受体的空间结构，这种空间结构不同于乙烯与受体结合后的空间结构，不具有乙烯与受体复合物所具有的生理活性，从而在较长的时间内阻止了乙烯受体与乙烯的结合，延缓了植物组织对乙烯的反应,乙烯等物质处理后受体位点恢复时间,乙烯在与受体结合位点结合以后，从结合位点扩散引起乙烯反应的时间约为210分钟，而象一些其它的受体水平的抑制剂却往往需要几个小时或者几天的时间,解释了为什么在加入抑制剂后几个小时或者几天后植物材料或组织又重新对乙烯获得敏感的原因,2对乙烯合成的抑制,1-MCP可以通过阻碍乙烯与乙烯受体的结合，进而影响相应的信号转导，有效地减少延迟组织果实对乙烯的敏感性(Nakatska）,1-MCP还可以通过调控乙烯合成途径中ACS和AC0基因的表达影响乙烯的生物合成。,Pathak等和Nakatsuka等分别在香蕉和番茄上的研究表明，1-MCP对乙烯生物合成途径中的两个关键酶ACS和AC0活性产生了明显抑制,5 对果实软化的影响,1-MCP处理可以抑制香蕉、西红柿、苹果果实的软化,1-MCP还不同程度地抑制了鳄梨中的多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶、-半乳糖酶及纤维素酶的活性,在果实软化启动后再用1-MCP处理成熟的梨，发现1-MCP同样可以抑制梨果实进一步的软化。但如果对香蕉果实经乙烯处理后贮放3天，1-MCP便失去其软化的抑制作用(Jiang )，这说明1-MCP对香蕉软化的抑制效应仅与后熟早期有关。,3,1肥城桃,(1)对照(CK)：只在采前l O d喷清水，其它不作处理：,(2)1-MCP处理：采收后取部分未喷施AVG的果实20下用1000nL/L的1-MCP密闭熏蒸24 h(记为1-MCP)：,(3)乙烯利处理：采收后取部分果实在01 mll4的乙烯利中准确浸泡15 min(记为Ethrel)，经AvG和1-MCP处理果实浸清水15 min，取出晾干,试材取自山东省肥城市10年生桃园，部分果实采收前10 d喷施1.33 g/L的AVG，采后当天选用8-9成熟、无病虫害、机械伤、大小均一的果实立即进行进行处理如下：,以上处理完后分别放于20 和0(冷库)恒温恒湿(RH 80-90)环境中存放。,(4)AVG处理的果实，采收24 h后放入0(RH80-90)冷库中存放。,另取部分未经AVG处理的果实用500 nL/L的1-MCP依上法进行处理，主要用于比较1-MCP的浓度差异,2 苹果,自山东泰安红庙红富士园艺场。采后当天运至实验室。均挑选8-9成熟、大小均一、无病虫害和机械伤的果实，分为4组，每组50kg。各组处理如下：,4,用GC-9A气相色谱仪(载气为高纯N2，流速30 mL/min，FID检测器，色谱柱为2m X3mm,GDX-502玻璃柱,柱温70，检测室温度120)测定乙烯释放速率。,ACS的提取及活性测定按照吴有梅(吴有梅、刘愚)的方法，反应生成的ACC按(Li F J，Zhai H Q)的方法测定。,3 ACO活性的测定：,按Nadeau等的方法,取0.5 g果肉,切成1 mm厚的小片,置于装有2ml ACC溶液(0.5mmol/L，含有0.5mmol/L1KCl)的小瓶内,于摇床上摇l h,静置l1h后抽取1 ml气体测定乙烯释放量.离体ACO活性按照Pathak等和Fernandez-Mculet等的方法,略有改动：20 g果肉加少量石英沙,加液氮研磨匀浆,60 ml提取液中含有匀浆解冻后两层纱布过滤,20000g离心20min，上清液作为酶粗提液。反应混合液中含有0.1mol/L的Tricine，PH7.5，10甘油(V/V)，30 mmol/L 抗坏血酸钠，1mmol /lACC,0.1 mmol/L硫酸亚铁和20 mmol/L碳酸氢钠,0.3 mL提取液,总体积为1 ml，30下温育30min，以生成乙烯的量表示ACO活性。,用GY-1型硬度计测定果实去皮硬度。每果测4次，每次5个果。,5,对不同品种/树种果实乙烯释放速率的影响,乙烯利可以明显促进跃变型果实的乙烯释放。本试验中，0下贮藏的肥城桃在乙烯利处理后乙烯跃变高峰比对照提前了5 d，峰值也比对照提高了44.11(图1-A)，20下贮藏的肥城桃果实乙烯峰值也比对照提高了39.04，但峰值出现时间与对照相同，这可能是因为对照果实在20下成熟同样很快的原因(图1-B)。,对不同品种/树种果实乙烯释放速率的影响,20下存放的富士和红星苹果果实乙烯释放的高峰同样受外源乙烯刺激而提前出现，峰值也分别被提高了13.17和56.33(图2-A、B)。,对不同品种/树种果实乙烯释放速率的影响,在非跃变型的草莓果实中，无论是在0还是20，乙烯利处理初期(第1 d,20；前4 d，0)果实乙烯的释放都受到了刺激而上升，表明外源乙烯也能够短暂促进非跃变型果实乙烯的释放(图3-A、B)。,1-MCP处理后20贮藏的草莓乙烯释放迅速表现出了明显的受抑制现象，在0下更是自第4 d起就一直没有检测到乙烯的释放(图3-A、B)，表明1-MCP也能够对非跃变型的草莓果实采后内源乙烯的生成产生明显的抑制。,对不同品种/树种果实乙烯释放速率的影响,为了进一步验证1一MCP对外源乙烯的竞争性抑制作用，分别对苹果和草莓在1-MCP处理后立即用乙烯利作进一步的处理(1-MCP+Ethrel),苹果中1-MCP都对外源乙烯表现出了明显的拮抗作用，1-MCP处理和1MCP+Ethrel处理的果实乙烯释放曲线类似，二者没有表现出明显差异；但非跃变型的草莓果实中，1-MCP处理并没有对随后的乙烯利处理产生明显的抑制作用：在20下，1-MCP+Ethrel处理的果实乙烯释放只在第1 d稍微低于乙烯利处理的果实，其它时间的数据分析表明二者差异并不明显(r=0.977，P=0)在OC下贮藏的草莓除第6 d外乙烯释放甚至还高于乙烯利处理的果实,I-MCP对于跃变型果实和非跃变型果实中乙烯抑制的机理可能并不相同：在跃变型果实中1-MCP可以与乙烯受体结合，竞争性的结合乙烯受体，从而阻碍乙烯进一步发挥生理作用；而在非跃变型果实中，乙烯可能并不与受体结合，而是通过其它方式,2.1 对ACS和ACO活性的影响,ACS和ACO是乙烯合成途径中的两个关键酶，其活性高低决定了乙烯的产量。富士果实中，外源乙烯处理虽然没有提高果实ACS活性的峰值，但加速了果实贮藏前期ACS活性的升高，使ACS活性从第15 d起一直维持在一个较高水平(图4-A)；在对乙烯更为敏感的肥城桃果实中，乙烯利处理后果实ACS活性迅速提高，并在第10 d达到了活性高峰，比对照提前了5 d，峰值较对照高出16.58(图4-B)。这表明乙烯利处理能刺激果实ACS活性的上升。,2.1 对ACS和ACO活性的影响,1-MCP处理对果实贮藏前期的ACS活性无论是在肥城桃还是富士果实上都有一个轻微的刺激作用，但随之即对ACS活性产生了较为明显的抑制作用(富士果实在15 d后，肥城桃在15-25 d)，使这两种果实的ACS活性在贮藏过程中一直没有明显跃变高峰出现(图4-A、B)。因此,1-MCP对果实ACS活性的作用总体上表现为前期(系统I乙烯)的轻微促进和后期(系统II乙烯)的显著抑制。,对ACS和ACO活性的影响,ACO在果实成熟过程中也往往表现为限速酶(Yang and Hoffman)。在本试验中，乙烯利处理促进了富士果实中ACO活性的升高，将其峰值比对照提高了10.74(图5-A)。这种促进作用在肥城桃中表现更为明显：乙烯利处理不仅提高了ACO活性峰值(16.05)，还将其活性峰提前了5 d(图5-B)。但是用乙烯抑制剂1-MCP处理富士的结果却表明，1-MCP并没有抑制富士果实ACO的最终活性，只是延缓了其活性的升高速率和高峰出现时间。1-MCP通过延缓ACO活性的升高，抑制了富士果实的乙烯跃变。,2.2 对离体ACS和ACO活性的影响,为进一步验证1-MCP对果实中ACS和ACO活性的影响，以红星苹果果实为试材，进一步测定了离体条件下果实ACS和ACO的活性。对ACS的测定是指在1-MCP存在的条件下，让ACS提取液与SAM反应，以最终生成的乙烯量表示。数据分析的结果表明，其与对照的差异并不显著。同样在1-MCP存在的条件下测定ACO提取液与ACC反应后生成的乙烯产量，结果与对照相比同样差异不显著(表1)。这两个结果表明了至少在该试验条件1-MCP并不对离体ACS和ACO产生直接的抑制作用。,3 对不同处理果实硬度的影响,分别以富士和红星苹果和肥城桃为试材，对其进行乙烯利和1-MCP处理后发现，1-MCP均能较好的延缓果实硬度的下降，其效应以肥城桃最好，红星苹果次之，富士果实最弱，这与它们对乙烯的反应敏感程度是一致的,结论,6,A,B,通过对苹果和