幽门螺杆菌临床菌株的分离培养与鉴定

毕 业 设 计（论文）题目 幽门螺杆菌临床菌株的分离与培养与鉴定 学 院 药学与生物工程学院 专 业 制药工程 班 级 113100201 学生姓名 冯双 学号 11310020111 指导教师 叶翠莲 职称 讲师 时 间 2017 年 5 月 10 日 重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养目录摘要 .IIAbstract.III第一章 绪论 .11.幽门螺杆菌的介绍 .12.幽门螺杆菌的致病机制 .12.1幽门螺杆菌的定植 .22.2损伤胃黏膜 .32.3炎症与免疫反应 .42.4影响胃酸的分泌 .43.幽门螺杆菌的研究进展 .5第二章 实验材料、仪器和实验方法 .71.实验材料 .71.1幽门螺杆菌菌株 .71.2实验试剂 .71.3实验仪器 .72.实验方法 .82.1 培养基的配置 .82.2 菌株接种培养 .92.3 菌株的鉴定 .92.4 菌株的保存 .13第三章 实验结果与讨论 .141.接种培养 .142.菌株鉴定 .142.1 脲酶法检测结果 .142.2 革兰氏染色结果 .152.3 16sRNA鉴定结果 .153.讨论 .16致 谢 .17参考文献 .18重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养I摘要幽门螺杆菌（Hp）是一种呈 S形或螺旋状、革兰染色阴性的微需氧细菌，它 生存于胃部及十二指肠的各个区域内，是目前在世界范围内所知能够在人胃中生存的惟一微生物种类。1983 年，澳大利亚学者 Warren 和 Marshall 成功地将 Hp与慢性胃炎患者的胃粘膜隔离开来。自 Hp 分离后的 27年来，从毒理学、病理学、细菌学、流行病学，从基因组学、蛋白组学，从细胞水平到分子机制，科学家们都做了深入的研究，并取得了巨大的成就。幽门螺杆菌是全球范围内感染率比较高的慢性感染性致病菌，它定植了 50%以上人类人口的胃黏膜，引发各种慢性炎症。现已经科学家们验证，Hp 与消化性溃疡、慢性胃炎、胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤（ MALT）以及胃癌密切相关。1994 年，世界癌症研究机构将其列为 I 类致癌因子。另外，近年来还有研究表明，Hp 感染在营养代谢性疾病、心脑血管疾病、皮肤病和免疫性疾病等的发病中也起一定作用。关键词：幽门螺杆菌；胃黏膜；慢性胃炎；消化性溃疡重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养IIAbstractHelicobacter pylori (Hp) is a S-shaped or helical, gram-negative micro-aerobic bacteria, which survive in the stomach and duodenum of the various regions, is currently known around the world to The only microbiological species that survive in the human stomach. In 1983, Australian scholar Warren and Marshall succeeded in isolating Hp from the gastric mucosa of patients with chronic gastritis. Since the separation of Hp for 27 years, from the toxicology, pathology, bacteriology, epidemiology, from genomics, proteomics, from cell level to molecular mechanisms, scientists have done an in-depth study and have made great The achievements. Helicobacter pylori is a global infection rate is relatively high infection pathogens, it is planted more than 50% of the human population of the gastric mucosa, causing a variety of chronic inflammation. Scientists have now demonstrated that Hp is closely related to peptic ulcer, chronic gastritis, gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma (MALT) and gastric cancer. In 1994, the World Cancer Research Institute classified it as Class I carcinogens. In addition, studies have shown that Hp infection also plays a role in the pathogenesis of nutritional metabolic diseases, cardiovascular and cerebrovascular diseases, skin diseases and immune diseases.Key words: Helicobacter pylori; Gastric mucosa; Chronic gastritis; Peptic ulcer重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养0第一章 绪论1.幽门螺杆菌的介绍幽门螺杆菌或幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori），简称 Hp，是微需氧的革兰氏阴性微生物细菌 1，在胃部及十二指肠的各个区域内生存，是目前在世界范围内所知能够在人胃中生存的惟一微生物种类。1983 年由巴里马歇尔（BarryJ.Marshall）和罗宾 沃（J.RobinWarren ）从慢性活动性胃炎病症患者的胃黏膜活检组织中分离成功，二人合力研究发现，Hp 是单极，末端钝，多鞭毛，螺旋状弯曲的细菌。长度为 2.54.0m，宽度为 0.51.0 m ，在胃黏膜上皮细胞表面常常呈现出典型的螺旋状或者弧形。幽门螺杆菌是一种对生长条件要求十分苛刻的细菌，其稳定的生长环境要求氧含量为 5至 8，因此在大气中或绝对无氧环境下不能生长。幽门螺杆菌是全球范围内感染率比较高的慢性感染性致病菌，它定植了 50%以上人类人口的胃黏膜，引发慢性炎症，这种炎症基本上都是无症状的，因此使得幽门螺杆菌感染者后期发展为慢性胃炎 2，消化性溃疡，胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌 3-5。 近年来的诸多研究可以发现，Hp 感染与皮肤疾病、心血管疾病、口腔疾病和血液系统疾病的发生有着密切的联系。Hp 是全球最常见的感染性致病菌之一，就目前的流行病学研究可表明，在一般发达国家，Hp 的感染率达 30%-50%6，而中国作为拥有 13 亿人口的发展中国家，是 Hp 的高感染区，Hp 的感染率甚至高达 40%-90%，平均感染率为 59%7。因此，就全球的 Hp 感染现状来看，治疗 Hp 引发的一系列病症已经不容忽视。2.幽门螺杆菌的致病机制现已经明确，Hp 与慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和黏膜相关性淋巴样组织（MALT）淋巴瘤密切相关，其致病机制非常复杂，目前认为 Hp 的致病机制包括：Hp 的定植、损害胃黏膜屏障、毒力基因造成的损害、炎症与免疫反应以及 Hp 感染后胃泌素和生长抑素调节失衡所致的胃酸分泌异常等。有定植因子、细胞因子、毒力因子、自由基毒力基因等多种 Hp 致病因子参与。重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养12.1幽门螺杆菌的定植Hp 天然定植部位经常在胃粘膜上皮表面和胃粘液底部。 Hp 在胃窦部数量最多，而胃体和胃底则较少。在胃腔环境的酸度较高的情况下，胃酸可以杀死多种细菌，所以正常的胃液中只能将极少量的细菌中分离出来。Hp 达到胃粘膜上皮表面和粘液底部这一特殊的生态圈，首先要依靠动力通过粘液层，还需要抵抗胃酸等不良因素的杀伤作用。（1）动力Hp 可以快速通过酸性环境的胃腔到达中性粘液层，并通过粘液层覆盖胃粘膜。 Hp呈螺旋状，两端钝，一端为 47 根鞭毛。螺旋结构提供了 Hp 在粘性胃粘液中运动的基础，而其鞭状体摆动提供足够的动力 8。鞭毛是 Hp 的动态器官，它每个鞘都有鞭毛，鞭毛有一定的保护作用，对胃酸也有一定的抵抗力。（2）对胃酸的抵抗作用Hp 可以在酸性环境中生存是其定植的关键。尿素酶是一种 Hp 产生的能够将尿素水解成氨和二氧化碳的酶，其在 Hp 的定植和存活中起着至关重要的作用。尿素酶分解尿素产生的氨能够在 Hp 周围形成“氨云” ，并在周围的胃酸中对 Hp 有一定的保护作用 9。而二氧化碳则以碳酸氢盐的形式进入到血液中，然后从呼吸道排出。除此以外，Hp 体内所含有的热休克蛋白，Hp 产生的型三磷酸腺苷酶以及抑制胃酸分泌的蛋白对 Hp 的生存也有一定的保护作用。 （3）保护性酶Hp 感染后，嗜中性粒细胞迁移至上皮细胞以杀死 Hp。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶均由 Hp 产生，它们可以保护 Hp 自身免受中性粒细胞杀伤作用 10。中性粒细胞的吞噬空泡中含有过氧化物，通过脂质过氧化和蛋白变性而起到一定的杀菌作用。Hp 的 SOD 能把过氧化物转化为过氧化氢，然后通过过氧化氢酶把过氧化氢分解为水和氧气，从而避免了白细胞的杀伤。 （4）粘附作用Hp 一旦通过黏液层后，就会粘附在胃上皮表面。 Hp 与上皮细胞接触后，将会促使肌动蛋白收缩，形成黏着蒂样的变化 11。Hp 紧密粘附于胃上皮表面可以避免使其与胃内的食物一道被排空，亦使其毒素容易作用于上皮细胞。Hp 这种特异性的粘附反映出其粘附因子的存在，而胃上皮细胞内存在粘附因子的特异性受体。重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养22.2损伤胃黏膜在正常的胃黏膜上，粘液上皮细胞由粘液和上皮细胞分泌，细胞一起进入胃粘膜屏障。这种屏障能够防止 H+的反向弥散。当黏膜受到 Hp 的损伤时，会致使 H+的反向弥散，进而导致黏膜损伤和溃疡形成。Hp 诱导的相关的黏膜炎症反应以及Hp 的毒素和有一定毒性作用的酶，都能够造成胃黏膜的损伤。（1）细胞毒素1988 年 Leunk 等 12发现 Hp 肉汤培养基的上清液含有细胞毒素，其允许 Hela 细胞引起不同程度的液泡变性。这种毒素称为空泡细胞毒素（VacA）。Hp 的 VacA基因在所有的 Hp 菌株中均存在，但是仅有 50%的菌株能够表达 VacA。VacA 对胃上皮细胞有着直接的毒性作用，能够损伤上皮细胞，致使细胞质中形成空泡，进而造成胃黏膜的损伤并延缓胃上皮细胞的自我修复。（2）尿素酶尿素酶除了本身能够起到一定的保护作用外，还可以破坏胃黏膜屏障。尿素酶产生的氨能够降低黏液中黏蛋白的含量，还能够破坏黏液的离子完整性，进而削弱了屏障功能，最终造成+ 的反向分散。除此之外，氨还能破坏三羧酸循环的需氧细胞，干扰细胞的正常能量代谢，造成细胞变性。近年来有相关资料数据显示，高浓度的氨能够导致细胞的空泡变性，产生的结果与 VacA 所造成的空泡变性相类似 13。除此以外，尿素酶分解产生的氨还能够为细菌本身的蛋白合成提供氮源。（3）黏液酶 在正常的情况下，胃上皮细胞可以分泌胃黏液，而黏液胶层的主要成分为黏蛋白，这是一种富含碳水化合物的高分子糖蛋白，在胃黏膜屏障中起着一定的作用。Hp 能产生一种溶解胃黏液的酶。胃黏液被降解会进一步促进 +的反向扩散，进而造成黏膜损伤；黏液的黏稠度降低更加有利于 Hp 的运动，使 Hp 易于定植；某些Hp 生长所需的营养物质来自于被分解后的黏液。 （4）脂多糖 Hp 产生的脂多糖（LPS）在一定程度上能够抑制宿主层粘连蛋白和嵌有脂质体的层粘连蛋白受体的相互结合。由于层粘连蛋白是一种维持上皮完整性所需要的细胞外基质，因此它与特异性受体的结合受到了抑制，将会导致胃黏膜的损伤 14。（5）脂酶和磷脂酶 A 重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养3正常的上皮细胞是由磷脂双分子层构成的。胃黏液中的脂质和磷脂在维持其粘性，防止+ 的反向弥散，保持疏水性上都起着重要作用。Hp 所产生的磷脂酶 A 能够把双软脂卵磷脂降解为游离的软脂酸和溶血卵磷脂，进而破坏细胞膜的完整性 15。（6）溶血素在培养基上生长出的某些 Hp 菌株能够分泌出一种溶血作用比较弱的溶血素，可以导致人、马、豚鼠、兔、羊血的溶血。Hp 的溶血素对于吞噬细胞的吞噬功能在一定程度上能够起着抵制作用，并对 Hp 加以保护。但是因其有细胞毒性，可以介导炎症反应，进而造成胃黏膜屏障的损伤。2.3炎症与免疫反应Hp 会导致胃、十二指肠产生炎症，引起人体的一些免疫反应。幽门螺杆菌感染后能够观察到胃黏膜细胞变性、坏死，炎症细胞浸润，血清中可以检测到特异性抗体。炎症和免疫反应都会导致胃黏膜屏障的损害，进而促使一系列疾病的发生。（1）炎症反应一般来说，大多数 Hp 在胃上皮表面和粘液底部，只有少量的细菌可以侵入粘膜进入本质层。Hp 入侵可以使其作为宿主免疫系统的抗原，诱导相应的免疫应答，此外，Hp 入侵可能引起耐药性，因此难以根除治疗。 Hp 慢性炎症会导致细胞增殖和自由基形成，在细胞增殖过程中，DNA 复制可能会发生一些错误，导致遗传突变。幽门螺杆菌感染时，巨噬细胞和中性粒细胞释放出的炎性介质会对宿主本身造成一定的损伤，而这些炎症介质和细胞因子包括了二十烷类，白三烯、前列腺素、PAF、血栓素、TNF 以及各种 IL 等，会对胃上皮细胞有直接的细胞毒性作用。（2）免疫反应 幽门螺杆菌感染时，会刺激浆细胞产生局部和全身的 Hp 特异性抗体，参与体液免疫反应。虽然 Hp 抗体能够与相应的抗原结合，但是这种体液免疫对于控制 Hp感染上，能够起到的作用甚微。而另一方面，这些抗体会造成宿主自身胃上皮的损伤。重庆理工大学毕业论文 幽门螺杆菌临床菌株的分离培养4Hp 感染时，各种炎症细胞会被活化和趋化，导致身体产生一系列 Hp 细胞免疫和体液免疫应答 16。Hp 感染形成的抗体能够与人胃窦部抗原有交叉免疫反应，一定程度上可能会诱发自身免疫反应。该自身免疫反应可能在胃粘膜全层炎症的发展中起作用。2.4影响胃酸的分泌