核酸扩增技术 ppt课件

核酸扩增技术,主要内容,第一节 聚合酶链反应技术第二节 荧光定量PCR技术第三节 其他核酸扩增技术第四节 临床基因扩增实验室的管理与质量控制,第一节 聚合酶链反应技术 polymerase chain reaction, PCR,一、 PCR技术发展简史二、 PCR技术原理三、 PCR反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析五、 PCR常见问题与原因分析六、PCR衍生技术,PCR技术发展简史,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。1985年Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使用的DNA聚合酶是Klenow片段。,(1993年诺贝尔化学奖获得者),PCR技术发展简史,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR。1988年Saiki 发现Taq DNA聚合酶，从此PCR技术得以广泛应用。,基本原理,N= N0(1+E)c,PCR反应体系、条件及其优化,PCR反应体系模板（template）引物（primers）DNA 聚合酶 (DNA polymerase)dNTP PCR缓冲液（PCR buffer）,PCR反应条件变性退火延伸循环,DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA,基因组DNA,质粒DNA,模板（template ）,引物（primers),引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。,3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。,引物设计总原则,引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。,引物设计一般原则,引物长度 碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3端引物5端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构,引物长度,一般为15-30个核苷酸，常用的是18-24 bp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点,碱基分布的均衡性,GC含量一般40-60%，推荐45-55%或50-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。同一碱基连续出现不应超过5个,引物Tm值,一般要求：55-65。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15,引物二级结构,引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物3端,引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3端不要出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，否则会使错误引发机率增加。引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。,引物5端,引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。,引物的保守性与特异性,保守性：通用引物检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增,扩增区域的二级结构,模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30Tm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length (primer premier 5.0)Tm product = 81.5 + 16.6(log10(Na+) + 0.41 (%G + %C) - 600/length (primer 3),引物与PCR,引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288G328T303-61）/VH2O VH2O (单位：L)退火温度最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of product) 25一般采用较引物Tm值低5作为PCR退火温度。,引物设计软件,Primer Premier 5.0 OligoPrimer expressprimer 3MethPrimer,DNA 聚合酶(DNA polymerase),特性：热稳定性:92.5、95、97.5时，半衰期分别为130min、40min、5-6min延伸效率:75-80时，150个核苷酸/s 校正功能:Taq DNA聚合酶没有3-5外切酶活性，Vent 、pfu等具有3-5外切酶活性,dNTP,dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：20-200umol/L dNTP会络合Mg2+，当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+浓度。,PCR缓冲液（PCR buffer）,一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温PH8.3) ，1.5mM MgCl2 Mg2+浓度：附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如Tween20，浓度0.05%）二甲亚砜（DMSO）,PCR一般方案反应组成,50 ul PCR反应体系的组成：样品DNA 0.11ug；正、负链引物（25umol/L）各1.0ul；脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul 10PCR缓冲液 5.0ul ； MgCl2（25mmol/L）3.0ul ； Taq DNA聚合酶12.5u ；蒸馏的去离子水补至50ul，短暂离心混匀。 阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。,PCR,94, 300S 94, 60S 30 55, 60S 72, 60S 72, 5-10min,（举例）,PCR一般方案热循环,PCR反应体系、条件的优化,三磷酸脱氧核苷酸耐热DNA聚合酶缓冲液模板核酸引物Mg2+,变性温度与时间复性温度与时间延伸温度与时间循环数和扩增效率降落PCR (Touchdown PCR)热启动PCR（hot start PCR）,降落 PCR(Touchdown PCR),根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越10-20的温度范围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低1-5），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度上循环2-5次。举例：如果一对引物的Tm值为60，可设置退火温度从63降低到48，每次降低1，每个退火温度循环两个周期，最后在48退火温度下做15个循环。,热启动PCR（hot start PCR）,PCR反应体系中先不加Taq DNA聚合酶，等PCR扩增仪的温度上升到80以后再加Taq DNA聚合酶。将石蜡珠在Ependorf管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上Taq DNA聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，Taq DNA聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀。在PCR反应液中加入Taq DNA聚合酶的单克隆抗体，再加入Taq DNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和Taq DNA聚合酶活性，Taq DNA聚合酶对引物无法进行延伸。待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。,扩增产物的检测及分析,凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法 PCR产物测序,琼脂糖凝胶电泳,制胶加样电泳紫外光检测,特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism),据目的基因序列可查出所包含的酶切位点，用相应的限制性核酸内切酶消化PCR扩增产物，然后进行电泳，观察消化片段的大小是否与序列资料相符。用途：传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。,单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP）,将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。,核酸探针杂交法,点杂交反向点杂交微孔板杂交荧光探针杂交法,点杂交（dot blot）,原理：将扩增产物变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。探针：放射性同位素标记探针检测的敏感、特异，具有不稳定性和放射性危害。非放射性物质（如生物素、地高辛、荧光素等）标记的探针稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。,反向点杂交(reverse dot blot),原理：使用带有标记物的引物进行PCR扩增，然后将扩增产物变性。将不同的寡核酸探针固定在尼龙膜上，用变性的PCR产物与之杂交。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。用途：反向点杂交特别适用于遗传性疾病多个位点的点突变分析。结果分析：正常纯合子突变纯合子杂合子,微孔板杂交( microplate hybridization),夹心杂交,荧光探针杂交法,目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、复合探针法等。,PCR产物测序,对PCR产物进行测序是检测PCR产物特异性最可靠的方法，可将PCR产物克隆到载体上进行测序，也可对直接PCR产物进行测序。,常见问题原因分析及处理,假阳性 非特异性PCR产物 假阴性 引物二聚体,假阳性,PCR产物是最主要的污染源。含有靶DNA序列的质粒的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PCR扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。,怎么可能全家人都得了性病 ?,何某，女，46岁，某部队卫生所护士，离婚10年，与一男友交往5年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看病。结果被告知是淋病，用了许多药，未见明显好转。她通过查书感到问题严重”，担心全家都会传染，尤其是正读初中的女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己的女儿、70岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、妹夫及14岁的外甥女都到医院检查。医师给他们用最先进的PCR”检测，结果6个人都是淋球菌感染”！,非特异性PCR产物,引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。Taq DNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。 Mg2+ 浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。,假阴性,引物设计是否合理 标本中是否有Taq酶抑制剂，Taq酶是否失活。反应体系中有无蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95以上加热10分钟使其灭活。反应体系中是否有较难去除的蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果。循环温度，特别是解链温度是否准确，退火温度是否过高。有些PCR仪指示温度与实际温度不符，过高则酶在前几个循环中迅速失活，过低则模板变性不彻底检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。靶序列发生突变、缺失等,引物二聚体,两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。引物模板比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。,PCR污染及预防措施,分开操作区域。耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。使用一次性Tip头、Eppendorf管等。 小量分装试剂。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。操作者带手套操作，且应勤换手套。使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制PCR产物交叉污染。 每次PCR操作都应设阳性及阴性对照 。,RNA酶的污染与预防,去除外源RNase污染玻璃器皿常规洗净后，应用0.1% DEPC处理。所有溶液应加DEPC至0.05%0.1%，室温处理过夜，然后高压处理。操作者戴口罩和手套。材料器材使用灭菌一次性用品。,抑制内源性RNase的活性使用低特异性RNase抑制物：如皂土、复合硅酸盐、肝素、DEPC等。去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白酶K、阴离子去污剂等，常与RNA酶抑制物联合使用，以加强对RNase活力的抑制。RNase的特异性抑制剂：如RNase阻抑蛋白（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物。,PCR衍生技术,巢式PCR（nested PCR ） 逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 重组PCR(recombinant PCR) 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不对称PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 定量PCR,巢式PCR（nested PCR）,逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）,逆转录酶AMV逆转录酶（最适温度为42）MoMLV逆转录酶（最适温度为37）逆转录引物随机引物；Oligo(dT)；特异性引物。one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。,多重PCR(multiplex PCR),重组PCR(recombinant PCR),锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）,基本原理：抽提细胞总RNA或mRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，通过DNA末端转移酶在cDNA 3端加上poly(dG)尾。据此设计锚定引物poly(dC)，为提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定引物5端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的3端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行PCR扩增。用途：检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。,不对称PCR（asymmetric PCR）,基本原理：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物(高浓度引物)与限制性引物(低浓度引物)，二者之比为50-100：1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA(ssDNA)。关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。也有人先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA；然后以双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单链DNA。,反向PCR（reverse PCR）,反向PCR用于快速扩增已知序列以外的未知DNA片段，从而对未知序进行分析研究。该法首先用已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸内切酶将模板DNA消化，再用连接酶使酶切产物环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环中。在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩增已知序列以外的区域。,反向PCR,已知序列,PCR,用途：未知序列的研究,限制酶切点（X）,限制酶切点（X）,限制酶X酶切,连接,未知序列,扩增长片段PCR（long PCR）,模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板DNA 。引物：一般较长（22-35nt），Tm值较大。DNA聚合酶：长片段PCR应采用错配率低的耐热DNA聚合酶：如Ampli Taq、rTth、Hot Tube、Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等。Vent、Deen Vent、Pfu、rTma等聚合酶有3-5外切酶活性。PCR缓冲液：增加Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力，并使缓冲液pH适度升高。此外，加入适量的甘油、DMSO（二甲亚砜）、明胶、聚乙二醇、Tween 20等物质，有助于模板变性和维持DNA聚合酶的稳定。热循环：增加延伸时间（一般1kb/min），提高退火温度，同时采用热启动。热循环后期，适当增加延伸时间，以保证产物充分延伸。,免疫PCR(immuno-PCR),原位PCR（in situ PCR ）,直接法：使用标记（放射性同位素、生物素、地高辛、荧光素等）的引物或脱氧三磷酸核苷酸（如dUTP）进行PCR扩增，则标记物掺入到PCR 产物中。最后用放射自显影、免疫组化或荧光法检测 PCR 产物及其在细胞内位置。间接法：先进行细胞内DNA的原位扩增，然后用标记的核酸探针进行原位杂交。原位逆转录PCR（in situ reverse transciption PCR）,定量PCR,概念：通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板进行定量的技术 。N= N0(1+E)c,定量PCR中扩增产物的检测方法,凝胶电泳：PCR-ELISA荧光PCR法由于荧光PCR可使用现代化仪器对PCR产物实行实时检测，很容易保证扩增在指数增长期内进行，是定量PCR扩增产物检测的一个发展方向。,第二节 荧光定量聚合酶链反应（Fluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR）,一、荧光定量PCR技术基本原理二、荧光定量PCR技术三、荧光定量PCR测定的数据处理四、实时荧光定量 PCR技术的应用,荧光定量PCR技术基本原理,荧光扩增曲线图Ct值标准定量曲线,荧光扩增曲线图,荧光定量PCR：通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线.,Ct 值,N= N0(1+E) clogN=logN0+clog(1+e),Ct值的重现性,PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。,初始模板量的对数与C(T)循环数之间 呈线性关系,标准定量曲线,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,荧光定量PCR技术,荧光染料法荧光标记探针 TaqMan荧光标记探针 molecular Beacon荧光标记探针 荧光标记杂交双探针,荧光染料法SYBR染料,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,SYBR-Green I,双链荧光染料,SYBR-Green I,溶解曲线分析（Tm）,特异性问题,TaqMan探针法,遵循一般引物设计原则；引物之间的Tm相差避免超过2； 为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；,TaqMan技术引物设计原则,TaqMan探针设计原则,先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近