鸡的大小黄白卵泡的分离和总RNA提取

鸡的大小黄白卵泡分离及总 RNA 的提取目录中文摘要： .2关键词： .2Abstract： .2前言 .21.材料和方法 .41.1 实验动物及其组织 .41.2 主要仪器和试剂 .41.2.1 实验仪器 .41.2.2 实验试剂 .41.2.3 溶液配制 .51.3 实验操作步骤 .51.3.1 取样 .51.3.2 大小黄白卵泡的提取 .61.3.3 总 RNA 的提取 .61.3.4 总 RNA 完整性鉴定 .61.3.5 总 RNA 内基因组 DNA 的去除 .61.3.6 反转录反应 .71.3.7 PCR 反应 .71.3.8 电泳检测 .71.3.9 PCR 产物纯化 .71.3.10 连接转化 .82.实验结论 .82.1 鸡卵泡颗粒细胞 .82.2 总 RNA 的检测结果 .92.3 PCR 检测 .93.分析讨论 .104.参考文献 .12中文摘要：实验前,在大量查阅各项相关研究资料的前提下，明确了 CART 与蛋鸡卵巢中不同大小黄白卵泡中的雌激素（Estrodiol, E2）和孕酮（P ）分泌量的关系。本实验运用显微外科手术技术分离蛋鸡的大小黄卵泡、大小白卵泡，并分别进行总 RNA 的提取，通过 CART mRNA 表达量的差异对 CART 蛋白进行定位，再通过体外注射 dsRNA 对 CART的表达进行抑制，阻断 CART 对蛋鸡卵巢中卵泡生长发育及排卵的影响，从而提高蛋鸡产蛋量，延长产蛋周期，降低料蛋比，进而通过饲养试验，确定调控效果，并将该技术进行全面示范推广。关键词：CART；卵泡；总 RNA；dsRNA；Abstract：According to the information of related research before experiments, we found out the relationships between the amount of estrogen(E2) and progesterone(P), which the layers follicle in different size secreted ,and CART. During this experiment ,we used the microsurgical technique to isolate different follicles including Rhubarb follicle(LYF) , Small white follicle (SWF), yellow follicle (SYF) and the follicle (LWF).Otherwise, we have picked up the total RNA respectively and located the CART protein through the different amount of CART expression. Finally, we have suppressed the influences of CART on the follicles growth and ovulation in ovarian by means of injecting dsRNA artificially .As to improve the layers production, prolong period of laying and reduce the ratio of forage and eggs, we conducted the feeding experiments and determined the effect of the results, and then apply comprehensively to the actual producatons.Key words：CART(Classification And Regression Tree) ； folliole； total RNA；前言我国蛋鸡已由上世纪 8090 年代的数量蓬勃发展阶段，逐步进入微利时代，蛋鸡养殖的行业优势、价格优势也日趋降低，并开始按发展竞争平稳运行三个阶段经济模式运作。目前蛋鸡产业在精细化的管理、先进技术的应用及市场信息的支撑方面，逐渐发展成熟、完善。因此，要想提高蛋鸡养殖利润就要从根本上提高蛋鸡的产蛋量，降低料蛋比。卵巢周期是产蛋过程的中心事件，只有成熟卵巢的卵泡才能释放卵子，然而，大于 99%的卵巢卵泡在其发生过程中死亡而不能排卵。促卵泡素（FSH）启动原始卵泡发育后，又进一步促进部分卵泡形成腔，进入有腔卵泡的生长期。在对牛的卵泡发育研究中表明，当原始卵泡发育到了 34mm 有腔卵泡期，通常就会出现一次 FSH 水平的瞬时提高。有腔卵泡的继续生长依赖于 FSH 的支持，FSH 刺激有腔卵泡的生长发育，同时又刺激颗粒细胞产生 FSH 受体（FSHR） ，随着 FSHR 数量的增加，卵泡颗粒细胞对 FSHR 反应也就越大，从而促使颗粒细胞不断发育。FSH 短暂的增加，并刺激一群小的有腔卵泡开始发育，这是一个卵泡发育波的开始，其中只有一个优势卵泡继续发育到排卵的大小，这时 FSH 的浓度下降，并产生大量的雌激素（Estrodiol, E2） ，而其余的从属卵泡失去了产生 E2的能力，并通过卵泡闭锁而死亡。近年来许多实验证明，在卵泡发育过程中，雌激素起着关键作用。E 2不仅能提高卵泡对 FSH 的摄取，而且还可以通过提高 FSH 的浓度来刺激 cAMP 的积累能力，从而进一步提高卵巢卵泡颗粒细胞对 FSH 的反应性，还能增进 FSH 刺激其受体作用，能使颗粒细胞促黄体生成素受体明显增加，大大提高卵泡对两种促性腺激素的反应性，最终促使卵泡发育成熟并排卵。卵巢内卵泡 E2产生能力的丧失导致卵泡闭锁。卵巢内雌激素产生是垂体促性腺激素和卵泡内调控分子的相互作用调控的，如类固醇激素和生长因子。蛋鸡卵巢大约包含 4000 个原始卵泡，每个原始卵泡都有潜力形成一枚蛋黄，但只有不足 1/4 卵泡能够发育成熟和排卵，而蛋鸡企业中每只蛋鸡产蛋期内排卵约 500550 枚，卵巢上大量参与发育的卵泡在其发生过程中闭锁和退化。卵泡发育过程中，垂体分泌的促性腺激素（E2 和 FSH）起着重要作用，促进卵母细胞的生长、卵泡细胞的增殖和卵泡腔的形成以及诱导卵泡排卵、黄体生成。近年来实验证明甾类激素，特别是 E2对调控卵泡发育和黄体生成过程也起着重要的作用。蛋鸡卵巢 E2对于卵泡的递次发育具有重要的调节作用，当卵巢上有最大卵泡存在的时候，其分泌的 E2在垂体前叶抑制 FSH 和排卵诱导素（OIH）的分泌，对其它中小卵泡的发育起到抑制作用。但是，在高产家禽，其体内 E2的含量也相对较高，因为这些家禽的卵巢上同时有数量较多的大中型卵泡存在，而 E2主要是由大中型卵泡分泌的。而孕酮（P）能够刺激卵泡壁细胞的蛋白分解酶和胶原水解酶的合成，这两种酶分解卵泡壁细胞而引发排卵。同时，P 对OIH 的释放也有作用。大剂量的 P 由于能够抑制 FSH 和 OIH 的分泌，对卵泡发育和排卵会起到抑制作用。CART 是近年来在动物体内发现的一种内源性神经肽，参与人和动物多方面的生理功能。Spiess 等 (1981) 在羊下丘脑的抽提物中分离出 CART，Western Blotting 也证实了 CART 肽在脑、内脏、肾上腺、垂体等处均有分布。近年来美国密歇根大学研究人员在对牛的研究中首次证实 CART 对卵泡健康状况有负调节作用，并且 CART 对牛颗粒细胞产生的 E2的基本含量也有负调控作用。同时，CART 抑制牛颗粒细胞内由 FSH 诱导的 cAMP 水平、E 2的积累和芳构化酶信使 RNA水平的升高，从而引起颗粒细胞的凋亡并最终引起卵母细胞的闭锁。李鹏飞（2011）以猪、羊为研究对象，首次证明了 CART 在猪、羊卵巢中有表达，并对该基因全 CDS 区进行了克隆与表达载体的构建，目前已通过对猪、绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养，研究 CART 与 E2产生的相互关系。dsRNA 是一种有互补链的 RNA，与细胞中发现的 DNA 相似，dsRNA 能够促发真核细胞中的 RNA 干扰，在细胞内诱导同源序列的基因表达受到抑制，引起脊椎动物中的干扰素反应。目前 RNA 干扰技术在科学界受到极大关注，主要是因为该项技术在干扰基因功能和相关方面的应用中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势：（1）特异性 dsRNA 干扰技术的最显著特征就是只引起与 dsRNA同源的 mRNA 降解。实验表明，dsRNA 能稳定表达的转基因和细胞内自身固有的内源基因表达，而对其它无关基因的表达不受影响；（2）高效性 无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的 dsRNA 就能有效的抑制靶基因表达，其介导的RNA 干扰是一个以催化放大的方式进行的；（3）dsRNA 长度限制性 引发有效的 RNA 干扰的 dsRNA 最短不得短于 21 碱基，同时长链 dsRNA 也在细胞内被Dicer 酶切割为 21nt 左右的 siRNA，并由 siRNA 来介导 mRNA 切割；（4）可传播性 dsRNA 具有跨越细胞界限的能力，在局部注射 dsRNA，能够传播到整个机体；（5）ATP 依赖性 dsRNA 干扰是一个 ATP 依赖的过程，整个过程由 ATP 提供能量。目前虽然仍未找到 CART 的受体，但已经明确 CART 实现其生物学功能的途径就是与其受体结合，如果通过阻断 CART 与其受体结合或能够抑制 CART 的合成和表达，对于蛋鸡产业而言，无疑是一项重大技术发现。1.材料和方法1.1 实验动物及其组织本实验材料均来自晋中市太谷县屠宰场。选取十只健康蛋鸡组成实验群。待蛋鸡宰杀后，取下所有的十个卵巢，投入冰盒中制备好的杜氏磷酸缓冲液（DPBS ）中，迅速带回实验室。1.2 主要仪器和试剂1.2.1 实验仪器表一 实验仪器仪器名称 型号 生产厂家制冰机 SIM-F124 SANYO超低温冰箱 UF-3410 Thermo超净工作台 DL-CG-2ND 哈东联电热恒温干燥箱 DEF-6210 上海一恒高速冷冻离心机 Centrifuge 5810R Eppendorf凝胶成像分析系统 GBS-7600B BIO-RADPCR 扩增仪 PTC200 TaKaRa电泳仪、电泳槽 DYY-12B 六一核酸蛋白检测系统 ND-100 Nanodrop恒温振荡培养箱 LRH-250E 广东医疗器械厂超纯水系统 NW10VF Healforce将需要清除 RNase 枪头、离心管等放入固相 RNase 清除剂工作液浸泡 5 min 以上，烘干备用。1.2.2 实验试剂表二.实验试剂试剂 货号 出产公司固相 RNase 清除剂 107105zyh AndybioTotal RNA 提取试剂 D9108A Takara反转录试剂盒 DRR047A Takara胶回收试剂盒 DV805A Takara连接转化试剂盒 D102A Takara感受态大肠杆菌 DH5 D9057 TakaraTaq DNA Polymerase ET101-01 北京天根生化科技有限公司dNTP Mixture CD117 北京天根生化科技有限公司1.2.3 溶液配制(1) DPBS 溶液：500 mL 蒸馏水 + 4 g NaCl + 0.1 gKCl + 0.1 g KH2PO4 + 0.575 g Na2HPO4，溶解后高压灭菌备用。(2) 50 TAE Buffer：242 g Tris，37.2g EDTANa2，57.1 mL 冰乙酸，NaOH溶液调 pH 至 8.3，加去离子水定容至 1 L 后室温保存。使用时稀释 50 倍。(3) 固相 RNase 清除剂：将蒸馏水与固相 RNase 清除剂按 1000:1 配制，室温下可保存 24 h。(4) EB 储液 (10 mg/mL)：1 g EB 溶于 100 mL 去离子水，4 棕色瓶避光保存。(5) LB 液培养基 1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，NaOH 调 pH 至 7.4，去离子水定容至 1L，高温高压湿热灭菌后 4 保存，用前 37 平衡。(6) LB 固体培养基 1000 mL：蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，Agar 15 g，NaOH 调 pH 至 7.4，去离子水定容至 1000mL，高温高压湿热灭菌，温度至 60 65 铺板，冷却后 4 保存，用前 37 平衡。(7) 氨苄青霉素(100 mg/mL)：氨苄青霉素 5 g，灭菌水定容至 50 mL，0.22 m 过滤膜过滤除菌，保存于20 。(8) X-Gal (20 mg/ml)：1 g X-Gal，二甲基甲酰胺定容至 50 mL，20 保存。(9) IPTG (24 mg/mL)：IPTG 1.2 g，灭菌水定容至 50 mL，0.22 m 过滤膜过滤除菌，20 保存。1.3 实验操作步骤1.3.1 取样（1）取卵泡：在细胞培养室将盛 70%酒精和 DPBS 溶液两个小培养皿放于纸巾上，一小烧杯内盛少量的培养液放于冰上。用眼科手术剪轻轻剪取 2 8 mm 卵泡，将剪下的卵泡在 70%酒精和 DPBS 溶液中各浸数秒后，用镊子夹入盛有培养液的烧杯内。（2）刮取颗粒细胞：超净台内放入盛冰的大烧杯，内放盛有卵泡的小烧杯和几只采血管，针管和胶头滴管放入采血管内。灭菌好的表面皿、刮刀、小剪刀、两把镊子和垃圾杯放入超净台内。将卵泡夹入表面皿，注入少量培养液，镊子夹住卵泡用针管刺破，小剪刀剪开卵泡后刮刀刮其内壁将颗粒细胞刮下，胶头滴管吸取细胞悬液至采血管中，残留物弃于垃圾杯，如此反复。1.3.2 大小黄白卵泡的提取禽类卵泡发育成熟的过程中具有优先等级的特点，即卵泡从小到大按排卵次序排列。鸡的卵泡一般按直径大小分类，等级前卵泡可分为:小白卵泡(SWF， 2mm)、大白卵泡(LWF，35mm)、小黄卵泡(SYF，68mm)和大黄卵泡(LYF，912mm)。由于卵泡膜都非常薄，所以通过显微外科手术获得完整的不同大小的黄、白卵泡，在技术上要求较高。1.3.3 总 RNA 的提取(1) 在分别装有大小黄白卵泡的 1.5 mL EP 管内加入 300 L Trizol，不停吹打直至细胞充分裂解，固形物消失，室温静置 5 min。(2) 向上一步的细胞裂解液中加 1/5 体积量 Trizol 的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡 15 s。待溶液充分乳化后，室温静置 5 min。(3) 12,000 g， 4 离心 15 min。(4) 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及下层带有颜色的有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中。(5) 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒充分混匀后，在 15 30 下静置 10 min。 (6) 12,000 g ,4 离心 10 min。(7) 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75%的乙醇 l mL (勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g，4 离心 5 min 后小心弃去乙醇。(8) 室温干燥沉淀 2 5 min，加入 30 L RNase Free 水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于80 保存。1.3.4 总 RNA 完整性鉴定（1）OD 260/OD280 比值测定：经微量核酸蛋白测定仪 OD260/OD280 比值在1.8 2.0 之间。初步确定样品 Total RNA 完整性较好。（2）大小黄白卵泡 Total RNA 电泳：取 50 mL RNase Free 加入 1 mL 50 TAE Buffer，0.5 g 琼脂糖，煮沸，稍凉后加入两滴 EB，凝固，制成 1% RNA电泳用胶。将 RNA 专用电泳槽用固相 RNase 清除剂工作液处理 5 min 以上，加入无 RNase 的 TAE 工作液。 Total RNA 5L 与 1L Loading Buffer 混合后点样。电压 200V 以上，电泳十分钟左右。经电泳检测，total RNA 的 28S、18S 和 5S 三条带可见，证明 total RNA 完整性良好。28S 、18S 、5S 分别具有 4700、1900、120 个核苷酸。1.3.5 总 RNA 内基因组 DNA 的去除使用 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒。试剂添加：2 L 的 5gDNA Eraser Buffer；1 L 的 gDNA Eraser； 1 g 的Total RNA；加 RNase Free dH2O 至总量为 10 L 。 反应条件：42 2 min4 1.3.6 反转录反应使用 Takara 公司 PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒。试剂添加：4 L 的 5PrimeScript Buffer 2，1 L 的 PrimeScript RT Enzyme Mix I；1 L 的 RT Primer Mix；10 L 去除基因组 DNA 后的 Total RNA，加RNase Free dH2O 至总量为 20 L。1.3.7 PCR 反应使用天根公司 Taq DNA Polymerase(含 10Taq Buffer)、dNTP Mixture。试剂添加：1 L 的 Forward Primer；1 L 的 Reverse Primer；2 L 的10Taq Buffer；1.6 L 的 dNTP Mixture，0.4 L 的 Taq DNA Polymerase；2 L的 cDNA；1.5 L 的 MgCl2；加 H2O 至总量为 20 uL。反应条件：94 2 min94 5 s60 30 s 35 循环72 30 s72 2 min1.3.8 电泳检测50mL 蒸馏水加入 1 mL 50 TAE Buffer，0.5 g 琼脂糖，煮沸，稍凉后加入 2 滴 EB，凝固，制成 1% DNA 电泳用胶。5 L PCR 产物与 1 L Loading Buffer 混合后点样。电压 130 V，电泳 30 min。1.3.9 PCR 产物纯化用 100 L PCR 产物电泳后，进行胶回收。步骤如下：(1) 在紫外灯下将目的条带切下，切碎后称重。1 mg 1 L 计算胶块体积。(2) 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer。1%浓度的胶加入 3 个凝胶体积量的 DR-I Buffer；1% 1.5%的胶加 4 个凝胶体积量；1.5% 2%的胶加 5 个凝胶体积量。(3) 均匀混合后 75 加热融化胶块。此时应间断振荡混合 6 10 min，使胶块充分融化。(4) 向上述胶块融化液中加入 DR-I Buffer 量的 1/2 体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于 400 bp 的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20的异丙醇。(5) 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。将上述操作 4 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 min，弃滤液。将滤液再加入Spin Column 中离心一次，以提高 DNA 的回收率。(6) 将 500 L 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 30 s，弃滤液。(7) 将 700 L 的 Rinse B (预先加入制定体积的无水乙醇) 加入 Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 s，弃滤液。(8) 重复操作步骤 7。(9) 将 Spin Column 安置于 Collection Tube 上，12,000 rpm 离心 1 min。(10) 将 Spin Column 安置于新的 1.5 mL 的离心管上，在 Spin Column 膜的中央处加入 25 L 的 60 灭菌蒸馏水或 60 Elution Buffer，室温静置 1 min。(11) 12,000 rpm 离心 1min 洗脱 DNA。(12) 纯化后的 PCR 产物存放于 20 备用。1.3.10 连接转化使用 Takara 公司的 pMD19-T Vector 试剂盒与 Takara 公司的感受态大肠杆菌 DH5。所有操作在冰上进行，操作步骤如下：(1) 在微量离心管中配制下列 DNA 溶液：1 L 的 pMD19-T Vector；0.1 pmol 0.3 pmol 的 Insert DNA；加 dH2O 至总量为 5 L。(2) 加入 5 L(等量)的 Solution I。(3) 16 反应 30 min。(4) 全量 (10 L)加入至 100 L 感受态大肠杆菌 DH5 中，冰中放置 30 min。(5) 42 加热约 1min，再在冰中放置约 2 min。(6) 加入约 1mL 无抗的 SOC 培养基，37 振荡培养 60 min，使大肠杆菌复苏。(7) 取约 200 L 复苏后的大肠杆菌涂在含 X-Gal、IPTG、Amp 的 LB 固体培养基上，37 培养约 12 h。(8) 将长出菌落